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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.3 Santiago mar. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000300005 

 

Caracterización molecular de
mecanismos de resistencia a cloranfenicol
en cepas de Shigella flexneri aisladas en
niños chilenos con diarrea aguda

Mauricio Farfán U1, Oscar Flores G1, Niurka Navarro G2,
Valeria Prado J, Guido Mora L3, Cecilia Toro U3.

Molecular characterization of resistance
mechanisms to chloramphenicol in
Shigella flexneri strains isolated from
Chilean children with acute diarrhea

Correspondencia a: Dra. Cecilia Toro: Programa de Microbiología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Independencia 1027, Santiago. E-mail: cetoro@machi.med.uchile.cl

Background: Chloramphenicol is one of the therapeutic options for shigellosis, but resistance to this antimicrobial is increasing. Aim: To characterize molecular mechanisms conferring resistance to chloramphenicol (CmR) in Shigella flexneri strains isolated from Chilean children with acute diarrhea. Material and methods: Thirty one Shigella filexneri strains, including 22 with the CmR phenotype were analyzed. Strains were tested for antimicrobial susceptibility by plate dilution and for the presence of an internal fragment of the cat gene encoding for chloramphenicol o-acetyl-transferase, by polymerase chain reaction and Southern blot analysis. Results: All CmR strains had a minimal inhibitory concentration over 64 µg/ml and amplified the internal fragment of the cat gene. Southern blot analyses indicated that this gene was located in the bacterial chromosome. Conclusions: Resistance to chloramphenicol in this group of Shigella flexneri strains was mediated by a chromosomally located cat gene (Rev Méd Chile 2002; 130: 275-80).
(Key-words: Chloramphenicol o-acetyl-transferase; Chloramphenicol resistance; Genes, cat; Shigella flexneri)

Recibido el 5 de septiembre, 2001. Aceptado en versión corregida el 2 de enero, 2002.
Trabajo financiado por proyecto FONDECYT 1000885.
Programa de Microbiología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Unidad de Microbiología, Departamento Genética Molecular y Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile.
1Licenciado en Bioquímica
2Bióloga
3Bioquímico PhD

Las infecciones por Shigella representan una de las principales causas de diarrea aguda junto con Escherichia coli enteropatógena clásica, E. coli enterotoxigénica, rotavirus y Campylobacter sp1,2. En América Latina, las infecciones por Shigella son endémicas y de mayor prevalencia en niños1-3. En Chile, Shigella es responsable del 4 al 12% de los casos de diarrea aguda y del 30% de las diarreas con sangre en niños menores de 5 años, siendo S. flexneri y S. sonnei las especies aisladas más frecuentemente2,4.

La shigellosis es una de las pocas infecciones entéricas cuyo tratamiento se ve beneficiado por el empleo de antimicrobianos, acortando de esta manera la severidad y duración de la infección, disminuyendo el tiempo de excreción del patógeno, como también las complicaciones potenciales de la infección3,4. Los antimicrobianos comúnmente recomendados son ampicilina, sulfametoxazol-trimetoprim (cotrimoxazol), ácido nalidíxico, furazolidona y cloranfenicol, indicados por breves períodos de tiempo, no mayores a 5 días5.

El alarmante incremento de cepas de Shigella resistentes a antibióticos de uso habitual en América Latina, requiere una cuidadosa selección del antimicrobiano a emplear3,5. En nuestro país, a partir de 1994 se introdujo el cloranfenicol como tratamiento de elección para la shigellosis, debido al aumento de la resistencia a ampicilina y posteriormente a cotrimoxazol3. Sin embargo, un estudio de vigilancia de resistencia a diferentes antimicrobianos mostró que 49% de las cepas de S. flexneri aisladas en niños de una comunidad semirural del área norte de Santiago entre los años 1995-1997, presentaba resistencia a cloranfenicol (CmR)2. Todas las cepas CmR presentan resistencia a ampicilina y tetraciclina simultáneamente, mientras que 40% de ellas presenta además resistencia a cotrimoxazol2.

El principal mecanismo que otorga resistencia a cloranfenicol es la inactivación del antibiótico por acetilación dependiente de la enzima cloranfenicol acetil-transferasa (CAT)6. Los genes que codifican para los distintos tipos de CAT, se encuentran ampliamente distribuidos tanto en cepas de Shigella como en otras enterobacterias, codificados en plasmidios o en el cromosoma bacteriano, asociados a la presencia de transposones e integrones6-8.

Debido al notable aumento de resistencia a cloranfenicol asociado a otros antimicrobianos en Shigella, es necesario conocer cuáles son los mecanismos moleculares involucrados en el fenotipo de multirresistencia, para facilitar el diseño de nuevas estrategias dirigidas a controlar y disminuir la diseminación de cepas multirresistentes asociadas a cuadros clínicos más severos. De acuerdo a lo anteriormente descrito, el objetivo de este trabajo fue caracterizar los mecanismos moleculares involucrados en la resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri, aisladas en niños chilenos con diarrea aguda.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas. Se analizaron 31 cepas de Shigella flexneri aisladas en 1997 obtenidas de un estudio de vigilancia de infecciones entéricas en una comunidad semirural del área norte de Santiago, realizado en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina, Universidad de Chile2. Las cepas de S. flexneri fueron identificadas por métodos convencionales y confirmadas por serotipificación, para luego ser agrupadas de acuerdo al fenotipo de resistencia determinado por el método Kirby Bauer2. Las cepas se mantuvieron congeladas a

-80°C en caldo Tripticasa Soya (TSB) - glicerol 50%. Para reactivarlas se sembraron en agar McConkey, incubándose por 18 a 24 h a 37°C.

Susceptibilidad antimicrobiana. La determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para cloranfenicol se realizó por el método de dilución en agar Mueller-Hinton (Tabla 1), de acuerdo a especificaciones establecidas por el NCCLS9.

Detección del gen cat

Amplificación por PCR. La presencia de este gen se detectó mediante la técnica de PCR, obteniéndose el ADN templado desde una alícuota de una suspensión bacteriana sometida a ebullición por 10 min. Se diseñaron partidores para el gen cat a partir de la secuencia del locus de multirresistencia descrito en S. flexneri (N° de acceso U81140), Cam-1(5´-AACGACCCTGCCCTGAAACC-3´) y Cam-2(5´-TTGCGCCGAATAAATACCTG-3´). El volumen final de la reacción fue 50 µl (buffer 10X 5 µl; MgCl2 25 mM 3 µl; dNTPs 10 mM 1 µl; 1 µl de cada partidor (10 pmol), Taq polimerasa 1 U; 3 µl de ADN templado). El programa de amplificación, realizado en un termociclador Mastercyclerâ, comprendió 30 ciclos a 92°C por 1 min; 52°C por 30 s; 72°C por 1 min, con un paso de extensión final a 72°C por 10 min. El producto esperado de 1003 pb fue separado por electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en tampón TAE 0,5X, teñido con bromuro de etidio y visualizado en un transiluminador UV. Como control positivo se utilizó el plasmidio pACYC184, el cual contiene el gen cat10.

Southern blot. Las extracciones de ADN cromosomal utilizando el detergente CETAB se realizaron de acuerdo a Ausubel y cols11. Las muestras de ADN plasmidial se obtuvieron mediante lisis alcalina de acuerdo a Sambrook y cols12. Ambas muestras fueron digeridas con la endonucleasa Bgl I o EcoR I y los fragmentos fueron separados mediante electroforesis en geles de agarosa 0,8% en tampón TAE 0,5X. El gel fue sometido a tratamientos con HCl 0,2 M; NaOH 1M NaCl 1,5 M; Tris-HCl 1M NaCl 1,5 M por 20 min cada uno a temperatura ambiente. La transferencia se realizó sobre membranas de Nylon Biodyneâ por 24 h utilizando una solución de SSC 10X, para luego fijar el ADN por exposición de la membrana a luz UV por 30 s. La hibridación se realizó a 65°C utilizando como sonda el fragmento obtenido por PCR a partir del plasmidio pACYC184, que fue marcado con biotina mediante el uso del kit BioPrimeâ DNA labeling system. Se realizaron lavados de alta estrictez para revelar la membrana usando el sistema Photogene Detection Systemâ y película Kodak X-OMAT, de acuerdo a instrucciones de los fabricantes.

Transferencia del fenotipo de resistencia. Se realizaron ensayos de conjugación en medio líquido por 2 h a 37°C entre las cepas de Shigella resistentes a cloranfenicol y la cepa receptora E. coli DH5a (resistente a ácido nalidíxico). Se seleccionó en agar Luria suplementado con cloranfenicol (40 µg/ml) y ácido nalidíxico (15 µg/ml), incubando 18 h a 28° y 37°C.

Los experimentos descritos en este trabajo fueron realizados en el laboratorio de Microbiología perteneciente al Programa de Microbiología, ICBM, Universidad de Chile, con excepción de los estudios de Southern blot, que se llevaron a cabo en el laboratorio de Microbiología, perteneciente al Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile.

RESULTADOS

Susceptibilidad a cloranfenicol. De las 31 cepas de Shigella flexneri analizadas, veintidós presentan resistencia a cloranfenicol (CmR). En la Tabla 1 se muestran los fenotipos de resistencia a diferentes antibióticos y la concentración inhibitoria mínima (CIM) para el cloranfenicol. De acuerdo al NCCLS, las cepas que presentan una CIM>8 µg/ml son resistentes a este antimicrobiano. En este estudio todas las cepas S. flexneri resistentes a cloranfenicol presentaron una CIM dentro del rango 64-256 µg/ml, lo cual es característico del fenotipo de resistencia conferido por la enzima cloranfenicol acetil-transferasa (CAT)6.

Detección del gen cat. Se detectó la presencia del gen que codifica para CAT, principal mecanismo de resistencia a cloranfenicol en enterobacterias, en el 100% de las cepas CmR. En estas cepas se amplificó el producto esperado de 1003 pb y no se obtuvo amplificación en las cepas sensibles a este antibiótico (Figura 1).

Localización del gen cat. La presencia del gen cat se ha descrito tanto en el cromosoma bacteriano como en plasmidios de elevado peso molecular6. Para determinar si este gen se encuentra localizado en un plasmidio transferible, se realizaron estudios de conjugación del fenotipo CmR. Ninguna de las cepas CmR transfiere la resistencia a cloranfenicol a la cepa receptora E. coli DH5a. Por otra parte, el análisis de hibridación por Southern blot, utilizando una sonda específica para el gen cat, detectó la presencia de este gen en el ADN cromosomal extraído de las cepas CmR. Además, se reveló la existencia de 3 patrones de hibridación (Figura 2). Estudios similares utilizando ADN plasmidial de las cepas CmR demostraron la ausencia del gen cat en plasmidios (datos no mostrados).

Figura 1. Detección del gen cat mediante PCR. El fragmento amplificado tiene el tamaño esperado de 1003 pb.
Carriles: 1, ladder 1000 pb; 2,3,4,5,6 S. flexneri CmR; 7,8 S. flexneri CmS; 9 control positivo (pACYC184).

Figura 2. Análisis de hibridación Southern del gen cat en cepas de S. flexneri. a) Gel de agarosa al 0,8% de la digestión del ADN cromosomal con Bgl I. b) Patrones de hibridación obtenidos usando la sonda específica para el gen cat. Carriles: 1,2,3,5,6,7,8 corresponde a S. flexneri CmR; 4 corresponde a S. flexneri CmS; 9 control positivo (pACYC184 no digerido).

DISCUSIÓN

Uno de los aspectos importantes en el tratamiento de la shigellosis está definido por el uso de antimicrobianos, entre lo cuales, el cloranfenicol es uno de los más utilizados en niños chilenos3. En efecto, un estudio reciente realizado en nuestro país, mostró que este antibiótico se utilizó en 21% de las terapias empleadas en cuadros de shigellosis durante los años 1997 a 19994. A nivel mundial se ha observado un notable incremento de cepas de Shigella resistente a cloranfenicol. Esta situación se ve mayormente afectada con el aislamiento de cepas que presentan más de una resistencia, convirtiéndolas en multirresistentes 3,13,14. Esto ha traído como consecuencia, la introducción de nuevas terapias contra shigellosis, basadas en el uso de cefalosporinas de tercera generación y nuevas quinolonas, estas últimas de uso muy restringido en niños3.

En la actualidad los mecanismos descritos que otorgan resistencia a cloranfenicol son (i) acetilación del antibiótico por la acción de la enzima cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) codificada en plasmidios o en el cromosoma bacteriano6, (ii) disminución de la concentración del antibiótico al interior de la bacteria por la presencia de bombas de eflujo inespecíficas15,16 y (iii) resistencia no enzimática a cloranfenicol por un mecanismo aún desconocido, posiblemente asociado a proteínas de transmembrana que impedirían el acceso del antibiótico al interior de la bacteria17.

Los valores de CIM asociados a la modificación enzimática del cloranfenicol se encuentran sobre los 64 µg/ml6, a diferencia de los otros dos mecanismos no enzimáticos, cuyos valores de CIM no superan los 16 µg/ml15-17.

Los valores de CIM obtenidos en las cepas de Shigella CmR del presente estudio se encuentran dentro del rango 64-256 µg/ml (Tabla 1), indicando que el principal mecanismo responsable de estos niveles de resistencia correspondería a la presencia de la enzima CAT. Estas observaciones fueron confirmadas mediante la amplificación por PCR del gen cat que codifica para la enzima CAT en todas las cepas de Shigella CmR (Figura 1).

Los estudios de hibridación por Southern blot realizados utilizando ADN cromosomal y ADN plasmidial, demuestran que en las cepas de Shigella CmR, el gen cat se encuentra en el cromosoma bacteriano, presentando tres patrones de hibridación, lo que sugiere una heterogeneidad en la ubicación del gen cat en el cromosoma de la cepas analizadas.

La localización cromosomal del gen cat limita la transferencia horizontal de este gen. Sin embargo, se ha descrito la asociación de este gen a elementos móviles como transposones (Tn9) e integrones localizados tanto en plasmidios como en el cromosoma bacteriano, haciendo de la adquisición del fenotipo de resistencia a cloranfenicol un proceso dinámico que otorga variabilidad a las enterobacterias7,8,17,18.

Nuestros resultados demuestran que la resistencia a cloranfenicol está determinada por la presencia del gen cat, sin embargo, no descartan la posibilidad que existan al mismo tiempo otros mecanismos que confieran resistencia a este antibiótico. Si bien, no se ha descrito la coexistencia de dos o más mecanismos de resistencia a cloranfenicol en enterobacterias, este evento ha sido detectado para otros antibióticos. Por ejemplo, se han descrito casos en que la resistencia a ß-lactámicos es conferida simultáneamente por la presencia de ß-lactamasas y la disminución de la permeabilidad de la membrana externa debida a la ausencia de porinas19,20.

Finalmente, es importante destacar que el conocimiento a nivel molecular de la resistencia a cloranfenicol facilitará el diseño de estrategias dirigidas a disminuir y controlar la diseminación del fenotipo CmR, ya que el uso de este antibiótico frente a cepas resistentes de Shigella, sin duda seleccionará este fenotipo, limitando el uso del cloranfenicol y probablemente el de otros antibióticos en el tratamiento de la shigellosis por cepas multirresistentes. Por otra parte, el conocimiento de las bases genéticas de la resistencia a antimicrobianos contribuirá a mejorar los tratamientos no sólo para Shigella sino también para otros patógenos.

REFERENCIAS

1. Carrasco S, Solari V, Prado V, Suazo L, Arellano C, Hernandez M, Espinoza C. Brote de Shigellosis en una Escuela de Educación Básica. Rev Chil Infect 2000; 17: 122-8.        [ Links ]

2. Prado V, Pidal P, Arellano C, Lagos R, San Martin O, Levine M. [Antimicrobial Multiresistance of Shigella sp Strains in a Semi rural Community of North Santiago]. Rev Méd Chile 1998; 126: 1464.        [ Links ]

3. Pidal P, Prado V, Trucco O. Panorama de la Resistencia Antimicrobiana de Shigella sp. en 10 Hospitales Chilenos. Rev Panam Infectol 1999; (supl. 1): S135-40.        [ Links ]

4. Delpiano L, Tejerina H, Cona E, Aviles C. Patrones de Sensibilidad in vitro y comportamiento clínico de Shigella. Rev Chil Infect 2001; 18: 101-7.        [ Links ]

5. Lopez E, Prado V, O´Ryan M, Contrini M. Shigella and Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Causing Bloody Diarrhea in Latin America. Infect Dis Clin North Am 2000; 14: 41-5.        [ Links ]

6. Murray I, Shaw W. O-acetyltransferases for Chloramphenicol and Other Natural Products. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1-6.        [ Links ]

7. Gomez-Luz R. Evolution of Bacterial Resistance to Antibiotics During the Last Three Decades. Internatl Microbiol 1998; 1: 279-84.        [ Links ]

8. Bunny K, Hall R, Stokes H. New Mobile Gene Cassettes Containing an Aminoglycoside Resistance Gene, aacA7, and a Chloramphenicol Resistance Gene, catB3, in an Integron in pBWH301. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 686-93.        [ Links ]

9. National Committee for Clinical Laboratory Standars. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 2001. Eleventh Informational Suplement M100-S11, 21(1).        [ Links ]

10. Chang A, Cohen S. Construction and Characterization of Amplifiable Multicopy DNA Cloning Vehicles Derived From the P15A Cryptic Miniplasmid. J Bacteriol 1978; 134: 1141-56.        [ Links ]

11. Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J, Struhl K. G Preparation and analysis of genomic DNA. Pág. 2.10. Short Protocols in Molecular Biology 1992; 2nd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y.        [ Links ]

12. Sambrook J, Fritish EF, Maniatis. Plasmid vectors, pág. 1.25. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 1989        [ Links ]

13. Lima A, Sidrim J, Lima N, Titlow W, Evans M, Greenberg R. Molecular Epidemiology of Multiply Antibiotics-Resistant Shigella flexneri in Fortaleza, Brazil. J Clin Microbiol 1997; 35: 1061-5.        [ Links ]

14. Chu Y, Houang E, Lyon D, Ling J, Ng T, Cheng A. Antimicrobial Resistance in Shigella flexneri and Shigella sonnei in Hong Kong, 1986 to 1995. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 440-3.        [ Links ]

15. Alekshun M, Levy S. Regulation of Chromosomally Mediated Multiple Antibiotic Resistance: the mar Regulon. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 2067-75.        [ Links ]

16. Mcmurry L, George A, Levy S. Active Efflux of Chloramphenicol in Susceptible Escherichia coli Strains in Multiple-Antibiotics-Resistance (Mar) Mutants. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 542-6.        [ Links ]

17. Ploy M, Courvalin P, Lambert T. Characterization of In40 of Enterobacter aerogenes BM2688, a Class 1 Integron with Two New Gene Cassettes, cmlA2 and qacF. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 2557-63.        [ Links ]

18. Hall R, Collis C. Mobile Cassettes and Integron: Capture and Spread of Genes by Site-Especific Recombination. Molec Microbiol 1995; 15: 593-600.        [ Links ]

19. Hernández-Allés S, Alberti S, Alvarez D, Doménech-Sánchez A, Martínez-Martínez L, Gil J, Tomás J, Benedi V. Porin expression in clinical isolates of Klebsiella pneumoniæ. Microbiol 1999; 145: 673-8.        [ Links ]

20. Stapleton P, Shannon K, French G. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 ß-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 1206-10.        [ Links ]