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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.2 Santiago feb. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000200003 

Los genotipos de Helicobacter pylori en
gastritis no atrófica difieren de los encontrados
en úlcera péptica, lesiones premalignas y
cáncer gástrico en Colombia

Helicobacter pylori genotypes in non atrophic
gastritis, peptic ulcer disease, premalignant
lesions and gastric cancer in Colombia

Diana M Cittelly P1, Mónica G Huertas2, Julián D Martínez,
Ricardo Oliveros, Héctor Posso, María Mercedes Bravo3,
Oscar Orozco D†

Correspondencia a: María Mercedes Bravo, MS. Laboratorio de Inmunología, Instituto Nacional de Cancerología. Calle 1ª Nº9-85, Santafé de Bogotá, Colombia, Sudamérica. Fax: 57 (1) 3372659. Teléfono: 57 (1) 3372659. E-mail: mmbravo@hotmail.com

Background: Helicobacter pylori is recognized as an etiologic agent of several gastric diseases. Bacterial genotypes have been related to clinical outcome in several populations. Aim: To compare cagA, vacA and iceA genotypes of Colombian isolates from patients with several gastrointestinal diseases, including gastric cancer. Material and methods: We used polymerase chain reactions to amplify vacA, cagA and iceA genes of 137 H pylori isolates coming from 26 patients with gastric cancer (GC), 34 with peptic ulcer (PU), 19 with intestinal metaplasia (IM), 23 with atrophic gastritis (AG) and 35 with non atrophic gastritis (NAG). Results: vacA s1-m1, cagA+, iceA+ were the most frequently found genotypes. vacA s1 and m1 subtypes were found in 92 (67%) and 82 (60%) cases respectively. Sixty three percent were cagA+ and 85% were iceA+. There was a lower prevalence of s1 allele in cases of NAG (43%), compared with GC, PU and IM (81%, 77% and 81% prevalence, respectively, p <0.01). Isolates from NAG also showed a low frequency of vacA m1 subtype (40%) compared with GC or IM (81% and 84% respectively, p <0.01). The prevalence of cagA+ strains was significantly higher in GC patients (80%) than in NAG patients (51.4%, p <0.01). No differences in the frequency of vacA s1a, s1b and iceA subtypes, were observed. Conclusions: A lower frequency of cytotoxic H pylori genotypes such as cagA and vacA s1m1 and a higher frequency of non cytotoxic genotypes, was observed in patients with NAG, when compared to patients with GC or PU. These results suggest that even in Colombia, vacA and cagA could be used as markers of increased virulence (Rev Méd Chile 2002; 130: 143-51).
(Key Words: Gastritis, atrophic; Gastritis, hypertrophic; Helicobacter pylori; Neoplasms, glandular and epithelial)

Recibido el 20 de agosto, 2001. Aceptado en versión corregida el 6 de diciembre, 2001.
Trabajo financiado por la Embajada Canadiense en Colombia a través de los fondos
obtenidos en la Carrera Terry Fox para la investigación en cáncer y por el
Instituto Nacional de Cancerología ESE, Bogotá, Colombia.
Laboratorio de Inmunología, Grupo de Gastroenterología y de Epidemiología,
Instituto Nacional de Cancerología. Bogotá, Colombia. Unidad de Gastroenterología,
Hospital Universitario La Samaritana. Bogotá, Colombia.
1 Bióloga, MS.; 2 Estudiante de Bacteriología.; 3 Microbióloga, MS.; † In memoriam.

Helicobacter pylori es un patógeno gástrico de amplia distribución mundial, aceptado como agente causal de la gastritis crónica, la enfermedad úlcero péptica y como un factor etiológico importante en la cadena de eventos que conduce al carcinoma gástrico, incluyendo la aparición de gastritis atrófica y metaplasia intestinal como eventos premalignos1-11.

Los intentos por identificar factores de virulencia de H pylori que conlleven a un mayor riesgo de desarrollar patologías severas, se han enfocado en el islote de patogenicidad cag (PAI) y la citotoxina vacuolizante, VacA. El gen cagA está localizado en el extremo de un fragmento de DNA de aproximadamente 40 Kb, denominado "islote de patogenicidad" (PAI), que codifica los componentes de un sistema de secreción y cuya presencia está asociada con una mayor respuesta inflamatoria gástrica12-15. Por otra parte, la toxina codificada por el gen vacA induce la formación de vacuolas en células epiteliales in vitro y causa daño epitelial y ulceración en modelos en ratones16-20. El análisis de múltiples cepas indica que todas poseen un tipo de secuencia señal s1 (subtipos s1a ó s1b) o s2 y un tipo de región media (m1 o m2). La vacuolización y las manifestaciones clínicas más severas se asocian con combinaciones alélicas particulares: la presencia de los alelos s1a y m1 está relacionada con mayores niveles de actividad vacuolizante que la de los alelos s1b ó s2 y m221,22. Recientemente se sugirió que el gen iceA, expresado diferencialmente cuando la bacteria se pone en contacto con células epiteliales, podría ser usado como marcador de virulencia, pues se encontró una alta frecuencia del alelo iceA1 en cepas aisladas de pacientes con úlcera duodenal23,24.

A pesar de que se ha demostrado que el genotipo vacA s1-m1 está asociado con úlcera péptica, en varios estudios se ha sugerido que la genotipificación de cagA, vacA e iceA parece no ser muy útil como marcador de virulencia en países como Colombia, en los cuales se encuentran niveles altos de genotipos vacA s1m1, cagA+, inclusive en pacientes con gastritis23. Sin embargo, en la mayor parte de estos estudios, no se consideran la gastritis atrófica y la metaplasia intestinal como patologías que representan estadios más avanzados de enfermedad, sino que son incluidas dentro del grupo denominado gastritis25. Este estudio fue diseñado para explorar la relación entre genotipos de H pylori y patología gástrica en la población colombiana, en particular en pacientes con gastritis atrófica, metaplasia intestinal, úlcera péptica, cáncer gástrico y pacientes asintomáticos con gastritis no atrófica.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas bacterianas y pacientes: Los aislados bacterianos se obtuvieron de pacientes que asistieron a las consultas de gastroenterología del Instituto Nacional de Cancerología y del Hospital Universitario de La Samaritana (Bogotá, Colombia) con diagnóstico de úlcera péptica (duodenal y gástrica), gastritis crónica no atrófica, gastritis crónica atrófica, metaplasia intestinal y adenocarcinoma gástrico. Adicionalmente se incluyeron cepas aisladas de voluntarios asintomáticos que participaron en el "Proyecto de pretamizaje de cáncer gástrico" realizado en el Instituto Nacional de Cancerología durante el año 1998 que cumplían con los criterios de inclusión. Todos los individuos consintieron su participación por escrito. Se excluyeron pacientes que habían recibido tratamientos con antibióticos durante los tres meses previos a la toma de muestras y tratamientos con radioterapia o quimioterapia en los pacientes con cáncer.

Mediante endoscopia se tomaron biopsias del antro y cuerpo gástrico para el diagnóstico histológico y cultivo bacteriano.

Aislamiento y cultivo: Las biopsias fueron transportadas en caldo Brucella (Gibco BRL) con 20% de glicerol. Las bacterias fueron cultivadas en agar Helicobacter pylori (Lab M, UK) suplementado con suero equino al 7% (Sigma), isovitalex al 1% (Oxoid) y suplemento selectivo Campylobacter (Merck); en atmósfera microaerofílica a 37°C.

Obtención de DNA y PCR: Para la obtención del DNA bacteriano se utilizó un protocolo establecido previamente26, en el cual una suspensión bacteriana (5x108 bacterias/1mL agua desionizada) es llevada a ebullición por 10 min para liberar el DNA e inactivar las nucleasas presentes. Después de centrifugar a 13000 rpm, por 1 min, el sobrenadante libre de residuos se emplea como fuente de DNA.

Los genotipos de vacA (s1/s2, s1a, s1b, m1 y m2), el gen cagA y los alelos iceA1 e iceA2, se evaluaron por PCR y se emplearon iniciadores reportados previamente (Tabla 1)27. Cada reacción de PCR contenía 1 U de Taq polimerasa (Gibco BRL); MgCl2 2,5 mM, dNTPs 0,2 mM; 0,5 uM de cada iniciador en buffer de PCR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH: 9,0), 0,1% Triton X-100) y 25 uL de DNA en un volumen final de 50 ul. Para la amplificación de los alelos de los genes vacA e iceA se realizaron 35 ciclos de denaturación a 94°C/1 min, hibridación a 52°C/1 min, extensión a 72°C/1 min, y una extensión final a 72°C/5 min, de acuerdo al protocolo reportado por Yamaoka23,26. Para la amplificación del gen cagA se realizó una denaturación inicial de 9 min a 94°C, seguida por 40 ciclos de denaturación a 95°C/30 s; hibridación a 50°C/45 s y extensión 72°C/45 s, con una extensión final a 72°C/5 min (Termociclador Perkin-Elmer 9600). Los productos de amplificación fueron separados en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio (0,5 ug/ml) y visualizados con luz ultravioleta.


Clasificación clínico-histológica. El diagnóstico histológico se realizó sobre cortes teñidos con Hematoxilina-eosina, según protocolos establecidos. La clasificación histológica de gastritis no atrófica, gastritis atrófica y metaplasia intestinal, se hizo de acuerdo a los parámetros del sistema Sydney25. En los casos en los que se presentaba más de una característica (ej: Metaplasia intestinal y gastritis atrófica) se escogió la patología más severa como diagnóstico de referencia (Metaplasia intestinal > gastritis atrófica > gastritis no atrófica). El grupo de úlcera péptica, se basó en la observación endoscópica.

Análisis Estadístico: En el análisis categórico de los datos, se utilizó la prueba c2 y la prueba exacta de Fisher, con el paquete estadístico SPSS versión 6.1. Un valor de p <0,05 se consideró significativo.

RESULTADOS

Genotipificación de H pylori. Se obtuvieron 137 aislados de H pylori provenientes de 82 hombres y 55 mujeres, con una edad promedio de 51 años. Se encontró una alta prevalencia de cepas con el genotipo vacAs1 de las cuales el 52,1% (49/92) correspondió al subtipo s1a, al igual que una alta frecuencia del genotipo vacAm1 (59,8%). El 63,7% de los aislados presentó el gen cagA y el 85% el gen iceA (Tabla 2).


Se comprobó la asociación entre la combinación de los alelos s1 y s2 con los alelos m1 y m2 respectivamente, pues se encontraron 63,3% de las cepas con genotipo vacA s1m1 (81/128), 31,3% vacA s2m2 (40/128), 7,7% vacA s1m2 (6/128) y solo una cepa con el genotipo s2m1 (p <0,000, se excluyeron los 9 casos de múltiples genotipos s1/s2, m1/m2).

Se observó asociación entre el genotipo vacA y la presencia de cagA, pues el 89% de las cepas cagA+ (72/81) eran vacAs1m1 y el 72% de las cepas cagA- eran a su vez vacAs2m2 (34/47) (p=0,000). No se encontraron asociaciones significativas entre genotipos vacA o cagA con la presencia de iceA o alguno de sus alelos (datos no mostrados).

El análisis de los alelos s1/s2, m1/m2 e IceA1/2 demostró la presencia de 28 casos de infecciones con cepas múltiples de H pylori en la población estudiada.

Genotipos y presentación clínica. Los 137 aislados provenían de 26 pacientes con diagnóstico de adenocarcinoma gástrico (ADG), 34 con úlcera péptica (UP), 19 con metaplasia intestinal (MI), 23 con gastritis atrófica (GA) y 35 con gastritis no atrófica (GNA). Los pacientes con UP, ADG y MI presentaron una frecuencia similar de cepas con genotipos s1 (Tabla 3). Se observó una prevalencia más baja de cepas con el genotipo vacAs1 en pacientes con GNA en comparación con pacientes con patologías más avanzadas como GA, MI, ACG o UP (p=0,008). De igual forma, el genotipo vacAm1 fue menos frecuente en pacientes con GNA y GA, en comparación con cepas de pacientes con MI y ADG (Tabla 3).


Como se observa en la Tabla 4, las cepas cagA+ fueron menos frecuentes en pacientes con GNA, en comparación con las otras patologías. Sólo se observaron diferencias significativas al compararlas con cepas aisladas de pacientes con ADG (p=0,023). Ni la presencia de cepas con genotipo iceA+ ni alguno de sus alelos se asoció con patologías particulares, aunque se observó una menor frecuencia del alelo iceA1 en cepas aisladas de pacientes con GNA y ADG (p=0,076) (Tabla 4).


En combinación, las cepas con el genotipo vacAs1m1cagA fueron las más frecuentes en la población estudiada (56%), seguidas por cepas vacAs2m2cagA- (27,2%). Las demás combinaciones alélicas se presentaron en frecuencias similares en el 16,8% de la población (datos no mostrados). En la Figura 1 se observa que las cepas no citotóxicas se encuentran con mayor frecuencia en pacientes con GNA que las cepas citotóxicas (p=0,009). La presencia del gen iceA no modificó estos resultados.


Figura 1. Frecuencia de cepas con genotipos citotóxicos (vacAs1m1cagA+) y no citotóxicos (VacA s2m2 cagA-) en las diferentes patologías.
GNA: Gastritis No-Atrófica; GA: Gastritis atrófica; MI: Metaplasia intestinal;
ADG: Adenocarcinoma gástrico; UP: Ulcera péptica.

DISCUSIÓN

Dada la importante asociación de la infección por H pylori con cáncer gástrico y úlcera péptica sería deseable eliminar este organismo de todas las personas infectadas. Sin embargo, debido a que pocos individuos desarrollan alguna sintomatología se hace necesario conocer los posibles marcadores de cepas que permitan definir la asociación con patologías severas2,29. En múltiples estudios se ha demostrado que en países desarrollados la tipificación de loci como cagA, vacA e iceA puede ser útil para definir cepas asociadas con úlcera péptica y cáncer gástrico, pero al parecer carece de validez en países en vías de desarrollo, con altas tasas de infección o en los cuales el componente medioambiental es un factor importante en la aparición de la enfermedad23,30,31. En todas las poblaciones mundiales estudiadas existe evidencia de que las cepas cagA+ tienen alta prevalencia, sin embargo, mientras que en varios países occidentales su presencia se asocia con un mayor riesgo de desarrollar enfermedad úlcero péptica, adenocarcinoma gástrico o sus lesiones precursoras2, en poblaciones con altas tasas de infección por H pylori es difícil encontrar tales asociaciones.

La prevalencia de infección por Helicobacter pylori en Colombia es muy alta (casi el 90% de la población adulta está infectada) por lo que es muy importante encontrar marcadores bacterianos que permitan identificar pacientes con mayor riesgo de desarrollar enfermedades severas32. En este estudio, a pesar de que se observó una alta prevalencia de cepas cagA+ en todos los grupos, no se observaron evidencias que sugieran que cagA+ por sí sólo sea marcador de enfermedad avanzada. Varios investigadores proponen que aun en cepas cagA+, la organización genética y la diversidad dentro del islote de Patogenicidad (PAI) pueden tener un efecto modificador del potencial patogénico de la cepa infectante, de manera que sólo las cepas con el PAI completo (sin deleciones ni modificaciones) son realmente virulentas15,33. Se ha descrito que cagE es un marcador importante de la capacidad de cepas cagA+ para inducir citoquinas pro-inflamatorias y por lo tanto puede ser un marcador útil para definir genotipos más tóxicos. La tipificación parcial de cagE en las cepas de este estudio indica que la mayoría de cepas cagA+ son también cagE+, sin embargo, el genotipo de la totalidad de las cepas se encuentra en ejecución.

Con respecto al gen vacA, la frecuencia del genotipo vacAs1a fue ligeramente mayor que la del genotipo s1b en la población general, hecho que confirma resultados reportados por Yamaoka y col23,34 quienes determinaron que el alelo s1a es predominante en población hispana (en un estudio que incluía aislados provenientes de pacientes colombianos).

Las cepas con combinación alélica vacAs2m2 son significativamente más frecuentes en pacientes con gastritis no atrófica que en las demás patologías a pesar de que las cepas vacAs1m1 tienen una prevalencia mucho mayor en la población general. Aunque la presencia de cagA por sí sólo no es un marcador de riesgo de enfermedad severa en esta población, su presencia suele estar ligada a la presencia del alelo vacAs1 por lo que las cepas con la combinación vacAs1m1 cagA+ (más citotóxicas) son mucho más frecuentes en patologías avanzadas que en gastritis no atrófica. Es claro que cuando se combinan los casos de gastritis no-atrófica con gastritis atrófica y metaplasia, las frecuencias relativas de cepas vacAs1m1cagA+ aumentan considerablemente, con una prevalencia similar a la encontrada en cáncer gástrico y úlcera péptica. Esto explica por qué en otros estudios en esta población, la frecuencia de cepas citotóxicas y no citotóxicas es similar tanto en enfermedades avanzadas como en pacientes con gastritis. Adicionalmente la alta frecuencia de cepas vacAs2m2 cagA- en pacientes con gastritis no atrófica, puede explicarse porque la mayoría de éstos fueron pacientes asintomáticos que se incluyeron como control poblacional en un programa de tamizaje de cáncer gástrico realizado por el Instituto Nacional de Cancerología (Bogotá, Colombia). Por definición, estos casos no acuden a los centros de diagnóstico endoscópico, por lo cual es improbable que las cepas provenientes de este grupo hayan sido analizadas en estudios previos.

De otra parte, existe controversia respecto al verdadero papel del loci iceA como marcador de virulencia, pues aunque inicialmente se reportó una alta frecuencia del alelo iceA1 en cepas aisladas de pacientes con úlcera duodenal23,24 en estudios posteriores no se ha confirmado esta observación. Los hallazgos de este estudio indican que pese a la alta prevalencia del gen iceA (84,4%) en la población analizada, ni la presencia de iceA ni la de alguna de sus variantes se asocia con alguna patología particular, a pesar de que se observa una mayor frecuencia del alelo iceA1 en cepas aisladas de pacientes con úlcera péptica. Estos resultados sugieren que la tipificación de este gen no es útil como marcador de virulencia por lo menos en la población colombiana.

En concordancia con lo reportado en otros estudios, existe una alta frecuencia de infecciones múltiples en cepas colombianas23 y no se observaron diferencias marcadas en la distribución de infección con múltiples genotipos y su asociación con la severidad de la enfermedad, hecho que parece estar relacionado con la alta tasa de infección por H pylori35,36. Varios autores han sugerido que la existencia de cepas con diferentes genotipos en un mismo paciente, puede representar una ventaja a la bacteria para sobrevivir en los diferentes nichos ecológicos de la mucosa gástrica o que puede llevar a que se presente cierta competencia entre las cepas por mantenerse en el ambiente gástrico. Este hecho dificulta el análisis de las asociaciones entre genotipos bacterianos y patología en esta población, dado que si varios genotipos se encuentran en un mismo paciente es muy difícil determinar cuál de ellos es responsable de la patología observada21.

En conclusión, a pesar de que se ha sugerido que la genotipificación puede jugar un papel muy importante para identificar las cepas circulantes en un área geográfica dada34,36 los hallazgos de este estudio sugieren que la subtipificación de los casos de gastritis, podrían ser útiles también para el análisis de los factores de virulencia de H pylori y sus consecuencias clínicas. Si bien estudios previos han demostrado que no existen diferencias entre los genotipos cagA o vacA y las manifestaciones clínicas de la infección en aislados colombianos, la separación de un grupo específico de gastritis no atrófica permitió demostrar que existe una frecuencia más baja de cepas con genotipos citotóxicos (cagA+, vacA s1-m1) en ese grupo. Estos resultados sugieren que inclusive en Colombia, cagA y posiblemente vacA pueden ser usados como marcadores de una mayor virulencia y riesgo de desarrollar patologías gástricas severas, aunque es claro que no serían útiles para diferenciar cepas ulcerogénicas y carcinogénicas.

Agradecimientos

Los autores agradecen la colaboración del equipo de endoscopia del Hospital Universitario de la Samaritana y de los grupos de Gastroenterología y Patología del Instituto Nacional de Cancerología. Este trabajo se hizo posible gracias al financiamiento otorgado por la Embajada de Canadá, con fondos de la Carrera Terry Fox para la investigación en cáncer.

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