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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.10 Santiago oct. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001001000006 

Helicobacter pylori: análisis de cagA y
genotipificación de vacA en Chile.
Detección de una cepa s2/m1

Helicobacter pylori: cagA status
and vacA genotyping in Chile.
Detection of a s2/m1 strain

Alejandra Martínez T, Carlos González C,
Fernando Kawaguchi P, Rolando Montoya,
Alejandro Corvalán, Jaime Madariaga B,
Jorge Roa S, Apolinaria García C,
Fernando Salgado , Henry Solar y Mariana Palma

Correspondencia a: Dra. Alejandra Martínez T. Ongolmo 443, Dp. 4. Concepción. E-mail: h.pylori@usa.net

Background: The genes cagA and vacA encode H pylori virulence factors. Aim: To genotype these genes in H pylori strains isolated from patients with upper gastrointestinal symptoms. Material and methods: We studied 50 patients who underwent an upper gastrointestinal endoscopy, with positive culture for H pylori. Detection of cagA and vacA gerotyping was done using polymerase chain reactions. Results: The gene cagA was detected in 19 samples (38%). Signal sequences s1 and s2 of vacA gene were detected in 16 samples each (32%). There was simultaneous amplification of s1 and s2 in 6 samples and they were not detected in 9 samples. The middle region of vacA was m1 in 9 samples, m2 in 29 samples and there was simultaneous amplification of m1 and m2 in 12 samples. In 16 samples (32%), more than one type of signal sequence or medial region was detected. Of those patients in whom vacA was the only genotype detected, 15 were s2/m2, 7 were s1/m1, 4 were s1/m2 and 1 was s2/m1. Conclusions: In these patients, the infection with cagA- H pylori strains, predominates, the prevalence of infection with s1 or s2 strains is similar and the predominant medial region is m2 (Rev Méd Chile 2001; 129: 1147-53).
(Key Words: Helicobacter pylori; Genotype; Genoma, bacterial))

Recibido el 16 de enero, 2001. Aceptado el 10 de agosto, 2001.
Trabajo financiado por la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción
(Proyecto Nº 993615-1) y Sección de Gastroenterología, Hospital del Trabajador de Concepción.
Facultad de Ciencias Biológicas y Facultad de Medicina, Universidad de Concepción. Sección de Gastroenterología, Hospital Asociación Chilena de Seguridad, Concepción.
Hospital San Borja Arriarán, Santiago, Chile
.

H elicobacter pylori, bacilo Gram negativo espiralado y microaerofílico, es el agente etiopatogénico de la gastritis crónica antral y de la enfermedad péptica ulcerosa1. Su distribución es mundial y la prevalencia de la infección por esta bacteria en Chile oscila entre 60 a 75%, dependiendo de la población estudiada2-6. La evolución de la infección depende tanto de factores del huésped como del microorganismo7. Se han descrito varios factores patogénicos de H pylori, algunos de los cuales son característicos de la especie y otros de presencia variable8. Dos importantes factores de virulencia de presencia variable son el antígeno A asociado a la citotoxina o CagA y la citotoxina vacuolizante o VacA, codificados por los genes cagA y vacA, respectivamente9. El gen cagA, marcador del islote de patogenicidad cag (o PAI), es de presencia variable, pero siempre expresado. Las cepas con este gen, cepas cagA+, se asocian con ulceración péptica, atrofia, metaplasia y cáncer gástrico10,11. El gen vacA está presente en todas las cepas, pero su expresión es variable. Presenta dos regiones variables: una en la secuencia señal (s) y otra en la región media (m) del gen, en base a las cuales se describen tipos de secuencia señal (s1 y s2) y de región media (m1 y m2), que permiten caracterizar el genotipo del gen vacA8. La secuencia señal s1 y la región media m1 se asocian a una acción más deletérea de la cepa infectante sobre la mucosa gástrica12. Así, la presencia de cagA, el tipo de secuencia señal y de región media de vacA constituyen marcadores de virulencia de las cepas de H pylori infectantes. Su prevalencia varía de acuerdo a la población estudiada y por esto, el objetivo de este estudio fue determinar en las cepas de H pylori aisladas de nuestros pacientes la presencia del gen cagA+ y el genotipo del gen vacA.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. Previo consentimiento informado y de acuerdo a la recomendación del European Helicobacter pylori Study Group (1997)13, se estudiaron 50 pacientes sometidos a gastroduodenoscopia por patología digestiva alta, de los que se tomó una biopsia antropilórica para cultivo.

Cultivo. Se realizó en agar Columbia suplementado con sangre de cordero al 5% y Dent, seguido de incubación en microaerofilia a 37°C por 5 días. La identificación de H pylori se realizó en base a las características de las colonias, tinción de Gram, prueba de ureasa y prueba de catalasa.

Amplificación por PCR. El ADN de H pylori se obtuvo por el método descrito por Mazurier et al (1992)14. La amplificación por PCR se realizó de acuerdo a las indicaciones de van Doorn et al (1998)15 en un termociclador Perkin-Elmer 480. La genotipificación de vacA se realizó en triplicado con los partidores de Atherton et al (1995)16 y un ensayo con partidores diseñados en base a la secuencia del gen (Tabla 1). La detección del gen cagA se realizó en triplicado con los partidores, F1-B116 y en duplicado con los oligonucleótidos CG3433 y CG3580 (Tabla 1). Los productos de amplificación fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 2 y 3%, seguido de tinción con bromuro de etidio y visualización bajo luz ultravioleta.


RESULTADOS

Detección de cagA. Se detectó infección con cepas cagA+ en 19 pacientes (38%). La Figura 1 muestra los resultados de la amplificación por PCR, con los partidores F1-B1, de muestras de 8 pacientes infectados con cepas cagA+.


Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 3% de amplificados del gen cagA obtenidos mediante PCR. Carril 1: marcador de tamaño molecular; carril 2: cepa de referencia cagA+; carriles 3 a 10: amplificados de cepas de H pylori cagA+ aisladas de 8 pacientes.

Secuencia señal de vacA. Del total de muestras analizadas, en 16 (32%) se detectó una secuencia señal de vacA del tipo s1; en 16 (32%) del tipo s2 y en 9 (18%) hubo amplificación simultánea de s1 y s2. Sin embargo, en 9 muestras (18%), la secuencia señal no fue tipificable (NT) con ninguno de los partidores utilizados (Figura 2).


Figura 2. Distribución porcentual de 50 pacientes con sintomatología digestiva de acuerdo al tipo de secuencia señal (A) y al tipo de región media (B) del gen vacA de H pylori, detectado mediante PCR.

Región media de vacA. Fue tipificable en todas las muestras. En 9 pacientes (18%), se detectó infección con cepas con una región media del tipo m1; en 29 (58%) del tipo m2 y en 12 (24%) hubo amplificación simultánea de m1 y m2. Por lo tanto, 41 de los pacientes estudiados (82%) tenían infección con cepas vacA m2 (Figura 2).

Genotipos vacA. Se detectó un solo genotipo vacA en 34 pacientes (68%) y amplificación de más de una secuencia señal o región media en 16 (32%). Del total de muestras en que se detectó sólo un genotipo vacA, 15 correspondían al genotipo s2/m2; 7 al s1/m1; 4 al s1/m2; 1 al s2/m1 (Figura 3). Además, 6 muestras fueron NT/m2 y 1 muestra NT/m1.


Figura 3. Distribución porcentual de 50 pacientes de acuerdo al número de genotipos del gen vacA detectados (A) y distribución de 34 pacientes infectados con un genotipo vacA según el genotipo detectado

DISCUSIÓN

Se describe que la mayoría de las cepas aisladas de pacientes con patología digestiva son cagA+, especialmente en pacientes con enfermedad péptica ulcerosa9,17, sin embargo, la prevalencia de cepas cagA+ es variable dependiendo de la población estudiada. Así, por ejemplo, en España se ha detectado 55% de cepas cagA+ en pacientes con sintomatología digestiva infectados con H pylori18; en Alemania, 72%19; en Sudáfrica, 95%, a pesar de que la ulceración péptica y el adenocarcinoma gástrico son de baja prevalencia20 en este país. Además, se ha descrito la génesis de cepas de H pylori recombinantes en pacientes con infección simultánea con cepas cagA+ y cagA-, en que las descendientes de la cepa cagA+ se hacen cagA- por recombinación21.

La similar prevalencia de los tipos s1 y s2 de secuencia señal del gen vacA, así como el predominio de la región media m2, difiere de lo observado en otros países latinoamericanos como Perú, Brasil, Costa Rica, Colombia15 y México22, en que se ha detectado predominio de infección con cepas s1/m1. En Polonia y Alemania, por el contrario, se ha observado predominio de la región media m219,23. Por lo tanto, existen variaciones en el tipo de secuencia señal y de región media predominante, de acuerdo al área geográfica.

El grupo de cepas con secuencia señal no tipificable se debería a variaciones, dependientes del área geográfica, en la secuencia nucleotídica de vacA, similar a lo observado por otros autores en relación a la región media23-25. Han et al (1998)24, detectaron una significativa diferencia en la secuencia nucleotídica del gen vacA en cepas cuya región media no lograron tipificar. De hecho, Atherton et al (1999)26, con el mismo sistema de genotipificación de vacA utilizado en este estudio, no lograron tipificar la región media de 22 cepas de pacientes de Sudamérica y Asia, debido a cambios en el sitio de alineamiento con el partidor de la región media, por lo que debieron diseñar un nuevo sistema de genotipificación aplicable a esta población.

La amplificación de más de un tipo de secuencia señal o de región media de vacA en las muestras, sugiere la presencia de infección múltiple. Esto concuerda con los hallazgos de otros autores que han detectado infección por múltiples cepas de H pylori tipificadas a través de diferentes genes. Así por ejemplo, los pacientes pueden presentar infección por poblaciones mixtas de H pylori cagA+ y cagA-9,27,28. En estudios de variabilidad genética realizados mediante amplificación polimórfica al azar del ADN (RAPD), Jorgensen et al (1996)29, detectaron que la mayoría de los pacientes estudiados estaban colonizados por una cepa predominante acompañada de hasta cinco variantes, además, detectaron infección simultánea con cepas susceptibles y resistentes a metronidazol; y en base a la genotipificación de vacA, Morales-Espinosa et al (1999)22, identificaron la presencia de infección por dos o más genotipos de vacA en 17 de 20 pacientes.

El hallazgo de una cepa con el genotipo vacA s2/m1, inicialmente considerado como inexistente, concuerda con estudios recientes en que se ha detectado este genotipo: en 5/20 pacientes estudiados en México22 y en 1/16 pacientes en población negra y mestiza de Sudáfrica30.

En conclusión, en los pacientes estudiados predominó la infección con cepas cagA-, se detectó similar prevalencia de los tipos s1 y s2 de secuencia señal del gen vacA y predominio de infección con cepas con una región media del tipo m2. En aproximadamente un tercio de los pacientes se detectó infección con más de un genotipo vacA. En los pacientes en que se detectó sólo un genotipo vacA, el más frecuente fue el s2/m2, seguido por el s1/m1 y el s1/m2; además, se detectó una cepa con el genotipo s2/m1.

Agradecimientos

A Laboratorios Silesia, Laboratorios Bagó, Laboratorios Andrómaco, Escuela de Graduados y Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción, por su colaboración en la presentación de parte de este estudio en el congreso Helicobacter pylori: Basic mechanisms to clinical cure, Bermuda 2000.

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