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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.10 Santiago oct. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001001000001 

Actividad rítmica espontánea en vasos
de placenta humana: ¿Un marcapaso
fisiológico en los vasos sanguíneos?

Spontaneous rhythmic contractions of
human umbilical vessels, evidences for
a physiological pacemaker in blood vessels?

Juan Pablo G Huidobro-Toro, Rolando González C1,
José Alejandro Varas F1, Alejandro Rahmer O,
Rolando González A

Correspondencia a: J Pablo G Huidobro-Toro, Centro de Regulación Celular y Patología. Instituto MIFAB, Depto. Fisiología Facultad Ciencias Biológicas P Universidad Católica de Chile.

Background: Placental vessels are not innervated. Therefore the vasomotor activity and vascular tone is not regulated by the nervous system. Aim: To assess the existence of pacemaker mechanisms related to rhythmic motor activity of blood vessels. Material and methods: Isometric contractions of rings from umbilical and chorionic vessels of term human placentas were monitored. Results: Recordings of the circular layer of chorionic and umbilical vessels revealed rhythmic spontaneous contractions with a frequency of 1,4±0,05 cycles/min, the duration of each cycle was 42,8±0,24 s (n=12). The amplitude of contractions was larger in veins than in arteries, predominating in umbilical vein biopsies, proximal to the fetus. Both the frequency and the amplitude of contractions were relatively constant during the first 30 min. However, after an hour, the frequency declined while the amplitude increased. The absence of the endothelium neither modified the frequency nor the amplitude of the rhythmic activity. Blockage of voltage dependent sodium channels or calcium channels did not alter the frequency of spontaneous contractions, although their magnitude was reduced. Glibenclamide, an ATP-dependent K+ channel blocker or the blockade of gap junctions ablated the frequency and amplitude of spontaneous contractions. Conclusions: We propose that rhythmic contractions are triggered by pacemaker cells located in the circular layer of the smooth muscle of blood vessels and spread via gap junctions; they likely contribute to the control of blood flow (Rev Méd Chile 2001; 129: 1105-12).
(Key Words: Spontaneous rhythmic activity; umbilical veins; chorionic vessels; vascular pacemaker; spontaneous rhythmic contractions)

Recibido el 2 de enero, 2001. Aceptado en versión corregida el 22 de agosto, 2001.
Trabajo financiado parcialmente por proyectos FONDECYT 01980966,
proyecto FONDAP 1398000 y MIFAB.
Centro de Regulación Celular y Patología, Instituto Milenio de Biología Fundamental
y Aplicada (MIFAB). Departamentos de Fisiología, Cardiología y Cirugía Digestiva,
Facultad de Ciencias Biológicas y Facultad de Medicina,
Pontificia Universidad Católica de Chile.
1Estudiantes de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile.

El corazón y otros órganos huecos como el intestino, los uréteres y el útero de término poseen actividad rítmica autónoma1. Una variedad de estudios han caracterizado los mecanismos del nódulo sinoatrial, que involucra células marcapaso en la generación del automatismo cardíaco1,2. Diferentes canales iónicos participan en la actividad de estas células marcapaso; los canales de calcio voltaje-dependiente están involucrados en la depolarización de fase cero del corazón humano. A pesar de los años de experiencia clínica en el diagnóstico de la actividad eléctrica del corazón, aún se desconoce en detalle la organización de las células marcapaso y las bases moleculares que explican el ritmo cardíaco. El peristaltismo intestinal es otro ejemplo de actividad espontánea que origina ondas contráctiles altamente coordinadas. Aunque no se conoce el mecanismo que genera este movimiento tan coordinado, diversos autores postulan que la célula intersticial de Cajal actuaría como un marcapaso en el tracto intestinal3-7, y que las uniones en hendidura intercelulares transmiten la actividad eléctrica generada por estas células tipo marcapaso. Es posible que en el útero de término también existan células con actividad de marcapaso que generen las ondas de contracción de este órgano.

Los vasos de la placenta carecen de inervación8, lo que permite suponer que el control de la actividad vasomotora y del tono vascular de la circulación materno-fetal no es regulado por el sistema nervioso. Por esta razón, el estudio de sustancias liberadas localmente que modulen los vasos de la placenta adquiere especial interés. No hay evidencias que los vasos sanguíneos tengan actividad de naturaleza rítmica, semejante a la desencadenada por células marcapaso de otros órganos. Estudios ecográficos muy recientes muestran que las venas de la placenta humana y de oveja tienen actividad pulsátil9,10 que en condiciones de hipoxia no siguen el ritmo cardíaco9. La detección ecográfica de estas ondas se usa para diagnosticar embarazos de alto riesgo9.

Considerando estos antecedentes, nos pareció relevante investigar la posible demostración de actividad rítmica espontánea (ARE) en vasos aislados de la placenta humana, semejante a la descrita en los estudios ecográficos de Hofstaetter y cols9. Esta investigación nos permitiría conocer las bases electrofisiológicas que gatillan esta ARE y dilucidar, por lo tanto, las condiciones fisiopatológicas que la desencadenan. Con este propósito, estudiamos la actividad motora isométrica de anillos de la vena umbilical de placentas normales de término. Nos pareció de interés fisiológico y patológico describir los mecanismos involucrados en la generación y mantención de la ARE, e identificar los eventuales canales iónicos y los mecanismos que coordinan estas contracciones. Deducimos que éstos deben ser independientes de los nervios perivasculares, ya que los vasos de la placenta carecen de inervación8. Esta ARE puede servir como un modelo de estudio en la búsqueda de células marcapaso en vasos sanguíneos de distintos territorios.

MATERIAL Y MÉTODO

Se prepararon anillos de vasos umbilicales y coriónicos de aproximadamente 3 mm de diámetro, de placentas obtenidas de partos normales o de cesáreas electivas del Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

Los estudios se realizaron previa autorización del comité de ética local para el uso de muestras humanas en investigación científica. Los anillos se incubaron en un baño de 5 ml con solución Tyrode (37°C, 95% O2, 5% CO2) por 60 min, con 1,5 g de tensión basal, condición previamente establecida como óptima para los registrar contracciones isométricas. Los anillos se conectaron mediante hilos a un transductor de tensión previamente calibrado que permite registrar la tensión isométrica de la capa muscular circular de las biopsias (ver detalles experimentales descritos por 11, 12). La solución del baño de incubación donde se mantienen las biopsias, se renovó periódicamente cada 15 min para evitar la acumulación de metabolitos que alteren la contracción muscular. En la gran mayoría de los estudios, el registro electromecánico se extendió por aproximadamente 2-3 h. Excepcionalmente se registró la actividad ARE durante 8 h. Para analizar la influencia del endotelio en la frecuencia y/o la amplitud de la ARE, se removió mecánicamente el endotelio11 y se determinó, en experimentos pareados, la frecuencia y amplitud de las ondas ARE de biopsias con y sin endotelio.

Para evaluar la influencia de ciertos canales iónicos en la ARE, se usaron drogas que actúan como bloqueadores selectivos de ciertos canales iónicos. En muchos de estos protocolos se realizó un estudio concentración-dependencia para asegurar que las drogas son usadas en condiciones farmacológicamente favorables. Con este propósito, se incubaron anillos de la vena umbilical con bloqueadores relativamente selectivos para cuatro tipos de canales iónicos comúnmente asociados con actividad marcapaso. Estas drogas se agregaron separadamente al baño de incubación por lo menos durante 20 min previo a la cuantificación de la frecuencia y amplitud de la ARE. La concentración de las drogas se expresó como concentración molar.

Luego de la recolección de los datos experimentales se cuantificó manualmente la frecuencia y amplitud de las ondas contráctiles, usando los registros poligráficos de los distintos protocolos. La frecuencia de las contracciones se expresó en ciclos por minuto, o como la duración de cada ciclo en segundos; la amplitud de las oscilaciones se cuantificó en gramos de tensión. En el análisis estadístico se usó ANOVA seguido de la prueba de Student no pareado, y cuando corresponde, de acuerdo con el diseño experimental, la prueba de Student-pareado. Algunos resultados se analizaron con las tablas de Dunnett que permiten múltiples comparaciones con un mismo control. El nivel de significación se estableció con un valor de p < 5%.

RESULTADOS

Características de la ARE. Los anillos de la vena umbilical y coriónica presentaron ondas de contracción rítmica de naturaleza espontánea, ARE, cuya frecuencia y amplitud fue uniforme y reproducible. La frecuencia de las ondas fue de 1,4±0,05 ciclos/min (n=12); la duración de cada ciclo fue de 42,8±0,24 s. La amplitud de las oscilaciones iniciales fue de 90±9,3 mg de tensión, valor que aumentó significativa y gradualmente en la próxima hora y se incrementó aún más al prolongarse el tiempo de registro. La ARE se observó más frecuentemente en las venas (17 de 20 placentas) que en las arterias (5 de 20). La amplitud de las ondas fue mucho mayor en los vasos del cordón umbilical que en los coriónicos (Figura 1). Mientras la ARE de la vena umbilical se mantuvo por horas, la de los vasos coriónicos decayó hasta desaparecer después de 30 min. La Figura 1 ilustra un registro típico y representativo de estas observaciones. Debido a estas consideraciones, nuestro estudio usó preferencialmente biopsias de la vena umbilical, preferentemente del segmento más próximo al feto.


Figura 1. Trazados representativos de registros electromecánicos de anillos de vasos de la placenta que presentan actividad rítmica espontánea (ARE). Las biopsias de los vasos umbilicales son de la misma placenta, mientras que los registros obtenidos de los vasos coriónicos corresponden a otra placenta. La ARE es de mayor magnitud en venas que en arterias y es más frecuente en la vena umbilical, preferentemente de segmentos más próximos al feto.

La remoción mecánica del endotelio, no afectó ni la frecuencia, ni la magnitud o la duración de la ARE (Tabla 1), sugiriendo su dependencia de mecanismos intrínsecos del músculo liso vascular, y no de factores endoteliales.

Si bien las ondas ARE de la vena umbilical se observaron durante horas, su frecuencia y amplitud no fue igual. La amplitud de las ondas aumentó gradualmente 2,5 veces mientras que la frecuencia disminuyó a la mitad a los 60 min de incubación. La Figura 2 muestra trazados poligráficos de 3 placentas que ilustran este fenómeno cuyo análisis estadístico se presenta en la Tabla 1. El producto de la frecuencia por la amplitud permaneció, sin embargo, constante durante el período de estas observaciones (Tabla 1).


Figura 2. Registros electromecánicos de anillos de venas umbilicales humanas sin endotelio. Se presentan trazados obtenidos de 3 estudios (A, B y C), que muestran la reproducibilidad de estas observaciones. Los registros de los paneles a la izquierda se obtuvieron durante el primer período de observación, que corresponde a los primeros 15 min luego de la incubación de las biopsias por 1 h con 1,5 g de tensión. Se muestra la evolución de la frecuencia y amplitud de la actividad rítmica espontánea de estas biopsias en los próximos 60 min. La calibración es la misma para las 3 preparaciones.


Estudio de los posibles canales iónicos involucrados en la ARE. Con el propósito de identificar los posibles canales iónicos involucrados en la ARE, se diseñaron protocolos con bloqueadores farmacológicos de los distintos canales iónicos. Estas drogas fueron aplicadas a los baños de incubación donde se mantienen las biopsias, en concentraciones que garantizan el bloqueo de la actividad de los respectivos canales sin dañar en forma muy notoria la actividad muscular. Registros representativos de las ondas ARE en ausencia y luego de 20 min de la aplicación de estos bloqueadores, se muestran en la Figura 3. El análisis estadístico de los cambios de frecuencia de las ondas ARE producidos por estas drogas se ilustran en la Figura 4.


Figura 3. Registros representativos de la actividad rítmica espontánea (ARE) obtenida de anillos de venas umbilicales antes y después de agregar diferentes bloqueadores de canales iónicos al baño que contiene estas biopsias. Cada registro proviene del estudio de un anillo, incubado en forma individual con las drogas señaladas.

Canales de sodio voltaje-dependiente. La aplicación de 0,2 µM tetrodotoxina, no modificó ni la frecuencia ni la amplitud de la ARE. De acuerdo con estudios previos, esta concentración de la droga bloquea casi completamente la conducción neuronal12.

Canales de calcio voltaje-dependiente. Si bien estas drogas a las concentraciones usadas, disminuyeron la tensión basal y la amplitud de las contracciones (Figura 3), no cambiaron la frecuencia de las ondas ARE (Figura 4). La incubación prolongada con 8 µM verapamil o con 3,3 µM mibefradil disminuyó la amplitud pero no la frecuencia de la ARE (Figura 4). Los efectos de estos antagonistas son reversibles. Experimentos paralelos evidenciaron que la disminución de la tensión basal de la biopsia no disminuyó la ARE.


Figura 4. Resumen del efecto de los bloqueadores de canales iónicos estudiados sobre la frecuencia de la actividad rítmica espontánea (ARE) de anillos de venas umbilicales en presencia de distintos bloqueadores: tetrodotoxina (TTX= 0,2 µM); nifedipina (NIF= 0,3 µM); verapamil (VP= 8 µM); mibefradil (MIB= 3,3 µM) y glibenclamida (Gli = 3 µM).
*** p <0,001; (prueba de
t-Student para datos pareados).

Canales de potasio dependiente de adenosina 5' trifosfato. Glibenclamida (3 µM), un conocido antagonista de los canales de potasio sensible a ATP, disminuyó a los pocos minutos de aplicación tanto la frecuencia como la amplitud de las ondas ARE (Figuras 3 y 4, p <0,001). Se observó además, una ligera disminución reversible del tono muscular, propio de estos antagonistas. El efecto de esta droga fue al eliminar la droga.

Bloqueo de las uniones intercelulares. Para evaluar si la ARE depende de uniones intercelulares asociadas con conexinas, se usó 20 µM 18 a-glicirretínico, compuesto que bloquea funcionalmente estas conexiones. Debido a que esta droga es poco soluble en el medio de incubación, el estudio se controló usando paralelamente un segmento de la vena umbilical para evaluar paralelamente la influencia del solvente. El bloqueo de las conexinas disminuyó rápidamente la amplitud de las ondas ARE, efecto que fue revertido al eliminarse la droga del baño. 90 mM Dimetil sulfóxido (DMSO), concentración de solvente usado para disolver este compuesto, no afectó ni la amplitud ni la frecuencia de la ARE (Figura 5), si bien relajó modestamente, al igual que el ácido 18 a-glicirretínico, la preparación, efecto que se evidenció por la disminución de la tensión basal. El lavado tanto del compuesto como del solvente, recuperó la tensión muscular basal.


Figura 5. Trazado poligráfico de un estudio representativo efectuado para evaluar la participación de las uniones en hendidura en la actividad rítmica espontánea (ARE) de anillos de vena umbilical humana. El trazado superior muestra la disminución de la amplitud de la ARE por acción de 20 µM 18 a-glicirretínico (GLY) y la recuperación tanto de la magnitud de la ARE como de la tensión basal de la biopsia por efecto del lavado de la droga (L). El trazado inferior es de un segmento adyacente de la vena umbilical que fue tratado con el solvente del ácido 18 a-glicirretínico que corresponde a 90 mM de dimetil sulfóxido (DMSO). Se observa que luego del lavado de las drogas, la tensión inicial se recupera.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran la existencia de ondas contráctiles rítmicas de aparición espontánea en vasos umbilicales humanos, preferentemente en la vena umbilical, consistente con las observaciones ecográficas de fetos en hipoxia9,10. La remoción mecánica del endotelio no modificó ni la frecuencia ni la amplitud de la ARE, lo que nos permite deducir que la ARE no depende funcionalmente del endotelio ni se modificó aparentemente por factores de origen endotelial. Por esta razón, es posible postular que la naturaleza espontánea de las ondas contráctiles de las venas umbilicales humanas es gatillada por un marcapaso localizado en la capa circular del músculo liso vascular. El hallazgo que la magnitud de la ARE es mayor en la vena umbilical que en la arteria, y en los vasos umbilicales más que en los coriónicos, es consistente con la hipótesis que la ARE favorece el flujo de sangre materno-fetal.

Este estudio demostró la evolución de las ondas ARE desde una etapa inicial con ciclos de 43 s hasta estadios posteriores caracterizados porque la frecuencia de la ARE disminuyó mientras la amplitud aumentó casi 3 veces. La actividad ARE se registró hasta 8 h después del montaje del vaso. Llama sin embargo la atención, que el producto de la frecuencia por la amplitud es constante. Esta observación, sumada al comportamiento inversamente proporcional de la frecuencia y amplitud de la ARE, permite sugerir que diferentes mecanismos de autorregulación, dependientes del músculo liso vascular, podrían participar regulando el flujo de la placenta. Resulta paradójico suponer que la ARE es un artefacto sin significado fisiológico, debido, por ejemplo, a daño de la biopsia, o muerte muscular, ya que la amplitud de las contracciones aumentó en forma consistente y significativa con el tiempo.

La hipótesis más sencilla que explica nuestros hallazgos postula la existencia de células marcapaso que gatillan la ARE. La Figura 6 ilustra un modelo hipotético que resume los aspectos más relevantes de nuestra hipótesis de trabajo. Proponemos que células tipo marcapaso, localizadas en la capa circular del músculo liso vascular, generan a través de canales iónicos impulsos eléctricos responsables de la despolarización rítmica de la capa muscular. Éstos se transmiten desde la capa muscular circular al resto del vaso a través de las uniones en hendidura. El bloqueo de estas uniones intercelulares con ácido 18 a-glicirretínico o con octanol (resultados aún no publicados, JPG Huidobro-Toro) suprimió la ARE, demostrando su participación en esta actividad. La propagación de las ondas de despolarización por estas uniones intercelulares coordina la actividad muscular, originando períodos de contracción, seguidos por otros de relajación. Es posible que las células marcapaso propuestas tengan semejanzas con las células intersticiales de Cajal4, las cuales en el intestino son aparentemente responsables de los fenómenos de despolarización espontánea.


Figura 6. Esquema que diagrama la hipótesis de trabajo. Se postula la existencia de células marcapaso en la camada circular del músculo liso de los vasos de la placenta. Las uniones en hendidura transmitirían la actividad eléctrica generada por esta célula marcapaso a las células musculares vecinas. La célula punteada representa una célula marcapaso; los diamantes y rectángulos representan las uniones en hendidura que transmiten las ondas de depolarización.

La distribución de estas células marcapaso debería ser lo suficientemente espaciada como para que segmentos de 3-5 mm de la vena umbilical presenten regularmente el marcapaso que origina la ARE. Como la frecuencia de descarga cambia con el tiempo de registro, es posible plantear que, o bien existen varios tipos de células marcapaso (focos ectópicos) que descargan cada cual con frecuencias diferentes, o bien la frecuencia de descarga de un mismo marcapaso se modifica con el desarrollo del protocolo, por factores que desconocemos. Sin duda, los resultados permiten sugerir que la densidad de las células marcapaso es mayor en la vena umbilical, especialmente en el segmento más contiguo al feto, que en otros vasos de la placenta. Estos hallazgos podrían indicar que existe una localización anatómica relativamente específica de las células marcapaso, y de los mecanismos electrofisiológicos responsables de la génesis de la actividad eléctrica que originan las ondas ARE.

Estudios farmacológicos permiten excluir los canales de sodio voltaje-dependiente sensibles a tetrodotoxina en la génesis de la ARE, excluyendo por el mismo argumento, la participación de nervios perivasculares. Además, el bloqueo selectivo de los canales de calcio voltaje-dependiente que participan de la regulación del automatismo cardíaco (canales de calcio tipo L y T) no parecen estar directamente relacionados con la regulación ni con la mantención de la ARE, pero participan manteniendo el tono vascular, a juzgar por la vasodilatación que provocaron. En contraste, el bloqueo de los canales de potasio dependientes de ATP, eliminó la ARE, evidenciando además un cierto grado de vasodilatación, lo que permite suponer la participación de los canales de potasio tanto en la génesis de la actividad eléctrica como en el tono muscular. En este último fenómeno obviamente también participan los canales de calcio voltaje-dependiente. Es importante comentar que la actividad ARE no parece depender del tono vascular, al menos dentro de ciertos límites experimentales, ya que el experimento con DMSO muestra claramente que la disminución de la tensión vasomotora no alteró ni la frecuencia ni la amplitud de las ondas ARE.

En resumen, los datos que se presentan muestran evidencias que sugieren, por primera vez, la existencia de un marcapaso en la vena umbilical humana, como un modelo que permitirá investigar la presencia de células marcapaso en otros territorios vasculares. Estas presuntas células con actividad de marcapaso se localizan en la capa circular de la vena umbilical y otros vasos de la placenta humana. Los resultados sugieren la participación de canales de potasio dependientes de ATP en el origen de las corrientes de despolarización de estas células, y las uniones en hendidura como el mecanismo de propagación de la actividad marcapaso. La ARE plantea nuevas oportunidades para investigar los mecanismos que controlan el flujo sanguíneo y dilucidar sus implicaciones en salud y enfermedad.

Agradecimientos:

A don Ramiro J Miranda, quien realizó algunos de los estudios presentados en este trabajo, y a Sonja Buvinic por su ayuda en la preparación editorial de este manuscrito.

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