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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.4 Santiago abr. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001000400004 

Diagnóstico molecular de los
síndromes de Prader-Willi y de
Angelman: análisis de metilación,
citogenética y FISH

Methylation, cytogenetic and FISH
tests in the molecular diagnosis of
Prader-Willi and Angelman
syndromes

Lorena Santa María V1, Bianca Curotto L2, Fanny Cortés M,
Cecilia Rojas B3 y M Angélica Alliende R4

Background: The diagnosis of Prader-Willi and Angelman syndromes is difficult, since their phenotypic manifestations are variable and unspecific. The study of the methylation state of DNA in l5(q11-q13) using polymerase chain reaction, called methylation test, allows the diagnosis of most patients with Prader-Willi and Angelman syndromes, irrespective if the underlying molecular alteration is a deletion, uniparental disomy or a punctual imprinting mutation. Aim: To assess the effectiveness of methylation test in the diagnosis of Prader-Willi and Angelman syndromes. Patients and methods: Thirty seven cases with a presumptive diagnosis of Prader-Willi syndrome and 25 with the presumptive diagnosis of Angelman syndrome were studied. Methylation test was done in genomic DNA obtained from peripheral Iymphocytes. Results: Methylation test confirmed the clinical diagnosis in 11 of 37 patients with PraderWilli (30%) and 6 of 25 patients with Angelman syndrome (24%). Conclusions: Clinical criteria overestimate the diagnosis of Prader-Willi and Angelman syndromes. The initial diagnosis should be confirmed with the methylation test and, if necessary, with FISH that will detect most deletions in the region. (Rev Méd Chile 2001, 129: 367-374)
(Key-Words: Angelman syndrome Cytogenetics; mutation; Prader-Willi syndrome)

Recibido el 14 de noviembre, 2000. Aceptado en versión corregida el 27 de febrero, 2001.
Laboratorio de Citogenética Molecular, INTA, Universidad de Chile. Unidad de Genética y
Enfermedades Metabólicas, INTA, Universidad de Chile.
Laboratorio de Biología Molecular, INTA, Universidad de Chile
1Bioquímico Universidad de Chile, 2Tecnólogo Médico. Universidad de Chile, 3Doctor
en Ciencias c/ m en Biología. Universidad de Chile, 4Magister en Ciencias Biológicas c/m en
Genética. Universidad de Chile.

Los síndromes de Prader Willi (SPW) y de Angelman (SA) son afecciones neurogenéticas con múltiples manifestaciones fenotípicas, que "mapean" en la misma región del cromosoma 151,2. El SPW tiene una incidencia estimada en 1/10.000 a 1/15.000 nacidos vivos3, mientras que el SA se presenta con una frecuencia de 1/12.000 a 1/20.000 nacidos vivos4.

En ambos cuadros el diagnóstico clínico se fundamenta en características fenotípicas variables e inespecíficas, especialmente durante el primer año de vida. En el caso del SPW, el diagnóstico se sospecha en todo recién nacido con hipotonía y dismorfias craneofaciales menores5,6. En los casos de SA, habitualmente el diagnóstico es más tardío, cercano a la edad preescolar, en individuos que presentan retraso severo del desarrollo, microcefalia, compromiso extrapiramidal, macrostomía, prognatismo, risa espasmódica, ausencia del lenguaje y alteraciones electroencefalográficas, con o sin convulsiones7.

Los antecedentes indican que ambos síndromes resultan de alteraciones moleculares, de distinta naturaleza, en la región 15q11-q13. Alrededor de 70 a 75% de los pacientes diagnosticados clínicamente con SPW o SA presentan una deleción cromosómica intersticial, de tamaño variable, en esta región. En los casos de SPW, la deleción reside en el cromosoma 15 de origen paterno; mientras que en el SA, la deleción se encuentra en el cromosoma 15 heredado de la madre8-10. El 25% de los casos de SPW presenta disomía uniparental del cromosoma 15 (DUP15), en la que ambos cromosomas 15 son heredados de la madre y el representante paterno está ausente11,12. En tanto, entre el 3 y el 5% de los casos de SA muestran la condición de DUP, con ambos cromosomas 15 de origen paterno13. Entre 10 y 15% de los pacientes con SA presenta mutaciones puntuales en el gen UBE3A, que codifica una ubiquitina ligasa, expresada desde el alelo materno en determinadas regiones del cerebro14-16. Por otra parte, 2 y 4% de los casos de SPW y SA respectivamente, presentan pequeñas deleciones, mutaciones puntuales u otras anomalías en el centro que controla la impronta (CI)15.

Ante la diversidad de manifestaciones clínicas que subyacen a estas afecciones es necesario, en primer lugar, confirmar que el cuadro clínico del paciente se relaciona con alguna de las alteraciones descritas en la región crítica de 15q11-13. Además, ya que ambos síndromes presentan características fenotípicas comunes con otras afecciones genéticas, la confirmación diagnóstica precoz a través de pruebas de laboratorio evita otros exámenes innecesarios y es fundamental para el manejo precoz de las complicaciones más frecuentes como convulsiones, obesidad, retraso motor y otras. Ello contribuye a mejorar el pronóstico en ambos cuadros y permite entregar el consejo genético a la familia.

Entre las pruebas de laboratorio utilizadas está la citogenética clásica, que permite identificar grandes deleciones del segmento 15q11-q13 y otras alteraciones cromosómicas, que pudieran ser responsables de fenotipos similares. Cuando se trata de microdeleciones del locus 15q11-q13 se debe recurrir a la hibridación in situ con sonda fluorescente (FISH), que es específica para la región crítica 15q11-q1317,18. Sin embargo, los casos de SPW o SA producidos por disomía uniparental del 15 (que representan el 25 y 5% respectivamente), pueden ser identificados mediante algún método que permita diferenciar el alelo materno del alelo paterno. Para ello se puede recurrir a digestión con endonucleasas de restricción (Ej. MspI/HpaII en el locus D15S632 o al análisis de metilación basado en PCR12).

La región 15q11-q13 alberga al gen SNRPN entre otros15,16 (Figura 1). La región promotora del gen SNRPN (ribonucleoproteína nuclear pequeña, polipéptido N) contiene una isla CpG, que se encuentra metilada en el alelo heredado de la madre y desmetilada en el alelo paterno. Esta metilación diferencial permite distinguir el origen materno o paterno de la región 15q11-q13 y constituye la base del análisis de metilación utilizado para el diagnóstico del SPW o SA. El ensayo consiste en la conversión de las citocinas no metiladas en uracilo, mediante tratamiento del ADN con bisulfito de sodio. Aquellas citocinas que se encuentran originalmente metiladas son resistentes a la modificación con el bisulfito y por ende, permanecen inalteradas. Así, mediante PCR y utilizando partidores específicos para las secuencias metiladas y no metiladas del gen SNRPN, es posible amplificar las secuencias correspondientes en el alelo materno y en el alelo paterno19-21.

Figura 1. Región crítica para SPW y SA que mapea en 15q11-q13. El diagrama muestra algunos de los genes que mapean en esta región y el estado de metilación del segmento cromosómico. Genes metilados en un solo alelo (circulo rojo), genes no metilados (circulo azul). Genes expresados (+) desde el alelo paterno (pat) o materno (mat). Adaptado de Ohta, 199915.

El análisis de metilación permite detectar el 99% de los casos de SPW y el 80% de los casos de SA cuya causa primaria es una deleción en 15q11-q13, una disomía uniparental del cromosoma 15 o un defecto en el centro de la impronta22. En estos casos, el análisis de metilación permite corroborar el diagnóstico clínico de manera rápida y con un costo relativamente bajo.

Este trabajo ilustra la aplicación del análisis de metilación a un grupo de pacientes con diagnóstico presuntivo de SPW y de SA y proponemos su utilización como primera prueba de laboratorio para la confirmación diagnóstica.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. Se estudiaron 62 pacientes, 28 hombres y 34 mujeres, cuyas edades fluctuaron entre 4 semanas y 21 años. Del total de pacientes, 37 corresponden a individuos con diagnóstico presuntivo de SPW y 25 a individuos con diagnóstico de SA.

De los 37 pacientes con diagnóstico presuntivo de SPW, 23 fueron sometidos a evaluación clínica según los criterios mayores de diagnóstico descritos por Holm en 19936 y conforman el grupo SPW-A. Los restantes 14 pacientes (grupo SPW-B), derivados directamente al laboratorio para el análisis, no fueron sometidos a esta evaluación clínica.

Los 25 pacientes con sospecha diagnóstica de SA fueron sometidos al tamizaje clínico habitual y presentaron al menos 70% de las características clásicas descritas para este sindrome: retraso mental/retraso del desarrollo psicomotor, microbraquicefalia, facie especial por macrostomía, nariz prominente, episodios de risa espasmódica, movimientos anormales, convulsiones/alteraciones electroencefalográficas, alteración (ausencia) del lenguaje4,7.

Análisis de Metilación. En todos los casos estudiados (62 pacientes y 16 controles), el ADN genómico se obtuvo a partir de linfocitos de sangre periférica, según la técnica de uso rutinario en este laboratorio23.

a. Conversión de citocinas en uracilo. La modificación del ADN se realizó según las modificaciones introducidas por Muralidhar y Butler21 de la técnica original24,25. Brevemente, 2 µg de ADN genómico es desnaturado con NaOH 0,3 M por 15 min a 37ºC y luego, modificado con hidroquinona 10 mM y metabisulfito de sodio 2M (Sigma, St. Louis, MO) a pH 5,0, incubando a 55ºC durante 16 a 18 h. El ADN modificado es purificado empleando el sistema Wizard DNA Clean-Up (Promega, Madison, WI), eluyendo con 100 µl de agua destilada. La modificación de las citosinas se completa incubando con NaOH 0,3M a 37ºC por 15 min. El ADN modificado es precipitado con etanol, resuspendido en 20 µl de agua y guardado a -20ºC hasta su utilización.

b. Amplificación mediante PCR de las secuencias metiladas y no metiladas. Como partidores se usó oligonucleótidos sintetizados comercialmente y complementarios a las secuencias genómicas del gen SNRPN (Genbank N° L32702) no modificado (WT), a las secuencias genómicas del alelo materno metilado (MET) y a secuencias genómicas del alelo paterno no metilado (NOMET) de este mismo gen. El tamaño de los productos de la amplificación con partidores MET, NOMET y WT es de 130 pb, 164 pb y 145 pb, respectivamente.

La reacción de amplificación mediante PCR se realizó en un volumen final de 25 µl, con buffer PCR 1x, MgCl2 1,5mM, 2 unidades de DNA polimerasa Taq (Gibco Life Technologies, Bethesda, MD), desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, TTP) 200 µM, partidores (MET, NOMET o WT) 0,8 µM y 3 µl de ADN modificado. El ADN fue desnaturado durante 5 min a 95ºC junto con el partidor reverso. El programa de amplificación consistió de 5 ciclos iniciales a 94ºC por 40 seg, 63ºC por 60 seg y 72ºC por 60 seg. Durante la siguiente etapa de desnaturación se agregó el partidor directo y la amplificación prosiguió por otros 30 ciclos en las mismas condiciones, finalizando con un paso de elongación a 72°C por 3 min. Para la amplificación con los dos partidores WT, el programa utilizado consistió de 30 ciclos a 94ºC por 1 min, 63ºC por 1 min y 72ºC por 1 min.

Los productos amplificados (12 µl de la mezcla de reacción) fueron separados mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3% en buffer TBE 1x, teñidos con bromuro de etidio, visualizados y fotografiados directamente bajo iluminación UV.

Las muestras de ADN de los 16 individuos control fueron procesadas anónimamente y en paralelo con aquellas de los pacientes.

FISH. En 7 de los casos que revelaron una anomalía de acuerdo al análisis de metilación, se realizó hibridación in situ con sonda fluorescente (FISH) en cromosomas metafásicos obtenidos de cultivo de linfocitos de sangre periférica, según la metodología descrita para el análisis citogenético.

Para el estudio de microdeleciones en la región 15q11-q13 se utilizó la sonda LSI Prader-Willi/ Angelman (Vysis), que es específica para la región crítica en el locus D15S10 del gen UBE3A y la secuencia control en 15q22. La hibridación se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se examinaron entre 30 y 50 metafases en cada paciente, utilizando un microscopio de epifluorescencia con filtro triple.

Análisis Citogenético. El estudio citogenético se realizó a partir de cultivos de linfocitos sincronizados con MTX (Metotrexato 10-4M) para obtener el bandeo de alta resolución (550-850 bandas). La recolección de linfocitos en metafase se efectuó según métodos modificados en nuestro laboratorio26. El análisis microscópico se realizó en al menos 35 mitosis con bandeo GTG.

El estudio citogenético se aplicó a 40 de los 62 considerados en este estudio. En los otros casos el estudio citogenético clásico está pendiente.

RESULTADOS

El análisis de metilación permite diferenciar el alelo materno y paterno del gen SNRPN, amplificando las secuencia metiladas y no metiladas correspondientes. Esta prueba aplicada al ADN de los individuos control (Figura 2A) muestra dos bandas; una, de 130 pb (de origen materno) y otra, de 164 pb (de origen paterno) (Carriles 1 y 2). En los carriles 5 y 6 se muestra la amplificación sólo de un fragmento de 130 pb, que corresponde al alelo materno del gen SNRPN, tal como se espera para individuos con SPW. En los carriles 3 y 4 se observa la amplificación de un único fragmento de 164 pb, que corresponde al alelo de origen paterno del gen SNRPN, característico de individuos con SA. El control de la especificidad de los partidores NOMET y MET empleados para la amplificación de las secuencias blanco (Figura 2B) muestra que, al utilizar como sustrato el ADN no modificado obtenido de un individuo control, no se observan productos de amplificación mediante PCR (carriles 1 y 4). En contraposición, en la reacción de PCR que utiliza partidores WT se obtiene un producto de 145 pb (carriles 2 y 3). Por lo tanto, los partidores NOMET y MET no reconocen secuencias de ADN sin modificar.

Figura 2. Análisis de metilación:
A. Productos de la amplificación mediante PCR de secuencias metiladas del gen SNRPN, usando como sustrato ADN modificado, obtenido de individuos control normal (carriles 1 y 2), de dos pacientes con SPW (carriles 5 y 6) y dos pacientes con SA (carriles 3 y 4). Alelo paterno, 164 pb y alelo materno, 130 pb. materno.
B. Amplificación del ADN no modificado de individuo control, usando los partidores MET (carril 1), con los partidores WT (carriles 2 y 3) y con los partidores NOMET (carril 4). Para A y B el carril del extremo izquierdo (St) corresponde al estándar de tamaño molecular, escalera de DNA de 50 pb (Gibco BRL)

El análisis de metilación se aplicó a 62 pacientes con diagnóstico clínico sugerente de SPW (37 casos) y de SA (25 casos). La Tabla 1 resume los resultados obtenidos. En 17 casos (27,4%), el análisis de metilación mostró un patrón de bandas consistente con la presencia de las alteraciones genéticas causantes de estos síndromes. Así, en el grupo SPW-A, el diagnóstico fue confirmado en 8 (34,8%) de los pacientes y en el grupo SPW-B, éste se confirmó en 3 (21,4%). En los pacientes con SA la prueba de metilación resultó alterado en 6 casos (24%).


En 7 de los 17 casos cuyo análisis de metilación mostró un patrón alterado, se realizó un estudio mediante FISH para determinar la ocurrencia de microdeleción en el locus 15q11-13. Estos resultados se resumen en la Tabla 2. La deleción fue confirmada en 4 de los 5 casos con SPW estudiados (Figura 3) y en el restante, el FISH no detectó anomalía. Por otra parte, en uno de los dos casos de SA estudiados mediante FISH, se detectó una deleción, mientras que el otro resultó normal.



Figura 3. FISH. Cromosomas metafásicos con hibridación in situ y fluorescencia utilizando la sonda de secuencia única D15S10, VYSIS para la región crítica 15 q11-q13 (señal roja bajo centrómero) y secuencias controles en brazo corto (señal verde) y en brazo largo ( señal roja terminal). La metafase muestra un cromosoma 15 normal y el homólogo con ausencia de señal en la región crítica, indicando una deleción.

Cuarenta de los pacientes fueron sometidos a análisis citogenético (Tabla 3). De ellos, 3 (7,5%) presentaron una alteración cromosómica estructural. Dos cariotipos, 46,XY,del(15)(q11-q13) y 45,XX, del(15)(q11-q13), der(13;14)mat son concordantes con SPW y el análisis de metilación señaló sólo la presencia del alelo materno. El tercer caso, con cariotipo 46,XY,t (5;7)(q12;q31) de novo, no mostró deleción en 15(q11-q13) mediante análisis citogenético y el análisis de metilación indicó un patrón normal. Por otra parte, los 12 casos con diagnóstico de SA presentaron un cariotipo normal.


DISCUSIÓN

La evaluación clínica de las características fenotípicas de los pacientes permite, en una primera etapa, plantear la sospecha diagnóstica de los Síndromes de Prader Willi y de Angelman. En el 99% de los casos en que se ha confirmado el SPW y en el 85% de los casos confirmados de SA, la causa primaria es una deleción en 15 11q-13q, la disomía uniparental del cromosoma 15 o una mutación en el centro de la impronta2.

El presente estudio documenta el uso de la prueba de metilación como una primera herramienta para la confirmación del diagnóstico en estos pacientes. El análisis de metilación de la región promotora del gen SNRPN distingue el origen parental del locus 15q11-q13, permitiendo identificar la presencia exclusiva del alelo paterno (en el SA) o del materno (en el SPW). Analizamos 62 pacientes que nos fueron referidos con un diagnóstico preliminar de SPW o de SA. Mediante el análisis de metilación detectamos la presencia de un solo alelo del locus 15q11-q13 en 17 (27,4%) de estos individuos; 11 de ellos diagnosticados con SPW y 6, con diagnóstico de SA. Al aplicar este análisis a los 37 pacientes con diagnóstico clínico sugerente de SPW, la prueba resultó positivo en el 29,7% del total de casos. Sin embargo, si se consideran sólo pacientes que fueron seleccionados según los criterios diagnósticos de Holms (grupo SPW-A), el porcentaje de positividad de la prueba aumentó a 34,8% (Tabla 1). Este resultado es similar al reportado por otros autores, que indican que la prueba de metilación confirma el diagnóstico en el 35.1% de los pacientes con sospecha clínica de SPW27.

Los antecedentes señalan que en ambos síndromes existe una correlación fenotipo -genotipo, siendo las manifestaciones fenotípicas menos severas en los casos de disomía uniparental que en aquellos producidos por deleción28-31. Ello enfatiza la importancia de determinar la causa primaria del síndrome. También resulta importante determinar la presencia de otras alteraciones concomitantes que tendrían influencia en el fenotipo clínico. En la literatura se describen 3 casos de SPW debido a DUP materna, con mosaico de trisomía 15, que presentan un fenotipo más severo que el clásico, con mayor frecuencia de cardiopatía30.

Con el propósito de precisar la naturaleza de la alteración en los pacientes estudiados, se realizó análisis citogenético clásico y FISH. El análisis citogenético de 40 casos mostró un total de 3 cariotipos alterados (7,5%). Sólo 2 de estos cariotipos presentaron la alteración característica del SPW (del15q11-13). A pesar que el estudio citogenético detecta un porcentaje bajo de los casos de SPW/SA (aquellos con deleciones extensas en el locus 15q11-q13), éste permite descartar otras alteraciones cromosómicas que pueden ser relevantes para el consejo genético.

La mayoría de los casos de SPW ocurren esporádicamente. Sin embargo, algunos pacientes son portadores de una translocación desbalanceada que involucra al cromosoma 15, con deleción de la región crítica en el alelo paterno5. Otros, tienen una translocación Robertsoniana balanceada con DUP15 materna1,33 y un tercer grupo, presenta una deleción de la región crítica derivada de translocaciones familiares que involucran el cromosoma 15, pero cuyos puntos de quiebre estarían lejanos de la región crítica34,35. En el presente estudio, uno de los casos con fenotipo SPW característico presentó un análisis de metilación anómalo y el estudio citogenético reveló una translocación Robertsoniana13,14 familiar, además de la deleción en 15q11-q13. La sola existencia de estos casos reafirma la utilidad del análisis citogenético.

El análisis mediante FISH permite la identificación de las deleciones en el locus 15q11-q13, que sería la causa primaria más frecuente de SPW y de SA, por lo que no sólo valida el diagnóstico basado en el análisis de metilación, sino que contribuye a precisar la naturaleza molecular de la alteración subyacente. Entre los casos de SPW que estudiamos mediante FISH, cuatro corresponden a una deleción y el otro pudiera corresponder a una disomía uniparental 15 materna o a un defecto del CI. De los dos casos de SA estudiados mediante FISH, uno de ellos corresponde a deleción y el otro caso nuevamente pudiera corresponder a una DUP 15 ó a un defecto del CI. La literatura informa que la condición DUP es poco frecuente (3-5%) en el SA. Creemos que el mayor porcentaje determinado en este trabajo es fortuito y probablemente, atribuible al bajo número de casos estudiados.

Un resultado del análisis de metilación alterado y FISH normal sugiere la existencia de una DUP 15 ó de alguna de las mutaciones descritas en el centro de la impronta.

Mutaciones en el gen UBE3A, que da cuenta del 10 al 15% en SA, no es advertida por los ensayos descritos y el diagnóstico molecular requiere de la secuenciación génica31, 36.

En resumen, dado que el diagnóstico clínico del SPW y SA presenta dificultades, especialmente en el primer año de vida, es aconsejable recurrir a estudios moleculares y citogenéticos que permitan precisar el diagnóstico27,28. Se propone el análisis de metilación como primer paso en la estrategia de diagnóstico de SPW y SA; seguido del estudio citogenético para descartar otra alteración cromosómica, cuando el cuadro clínico así lo sugiera35. El análisis de metilación es rápido, simple, de bajo costo y detecta un porcentaje significativo de los casos, lo que sustenta su aplicación para el diagnóstico inicial cuando existe sospecha clínica de alguno de estos síndromes. Si el análisis de metilación está alterado, se deberá realizar análisis mediante FISH y citogenética clásica. Si resulta normal, sólo se justifica realizar el estudio citogenético clásico que permita detectar otras posibles alteraciones cromosómicas.

Correpondencia a: M Angélica Alliende R. Laboratorio de Citogenética Molecular, INTA, Universidad de Chile. Macul 5540, casilla 138-11. Santiago de Chile.

Agradecimientos:

Los autores agradecen a la Dra. Ledia Troncoso la referencia de pacientes y su aporte crítico a la realización de este trabajo. A los Dres. Ximena Barraza y Andrés Barrios por la referencia de pacientes.

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