SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.128 número3Helicobacter pylori y gastritis crónica: relación entre infección y actividad inflamatoria en población de alto riesgo de cáncer gástrico índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.3 Santiago mar. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000300001 

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Mutación del gen p53
en el cáncer de la vesícula biliar

P53Gene mutation
in gallbladder cancer

Iván Roa E, Angélica Melo1, Juan Roa S, Juan Araya O,
Miguel Villaseca H, Xabier de Aretxabala U

 

Background: Gallbladder cancer frequency and mortality renders it one of the most important neoplastic diseases in Chile. P53 tumor suppressor gene has been studied in most types of cancer, but there is scarce information about it in gallbladder cancer. Aim: To study the frequency of P53 gene mutation in gallbladder cancer in the ninth region of Chile. Material and methods: In 25 pathological samples of gallbladder cancer, the direct amplification and sequencing of p53 gene exons 5,6,7,8-8 was possible. Results: Seventeen punctual mutations were observed in 13 cases (52%). There were 10 transitions, 5 transversions, one insertion (codon 194) and one deletion (codon 186). Eight cases had mutations in exon 5, six had mutations in exon 6, two had mutations in exon 7 and one had mutations in exons 8-9. In 14 of 25 cases, gene p53 protein was positive. When immunohistochemical expression of gene p53 protein was positive in more than 20% of cells, there was a high correlation between genetic alterations and immunohistochemical expression of the protein, with a specificity, sensitivity, positive and negative predictive values over 80%. Conclusions: P53 gene mutation is observed in a high proportion of gallbladder cancers at it can be accurately detected with conventional immunohistochemical techniques. The importance of this gene in the genesis of this carcinoma should be determined studying preneoplastic lesions and early carcinomas.
(Key-words: Gallbladder neoplasms; Genes Suppressor, tumor; Immunohistochemistry)

Recibido el 13 de abril, 1999. Aceptado en versión corregido el 28 de diciembre, 1999.
Trabajo financiado por Proyecto FONDECYT #1991025
Unidad de Anatomía Patológica y Citopatología Hospital Temuco y Departamento
de Cirugía. Facultad de Medicina. Universidad de la Frontera.
1 Tecnólogo Médico

Una serie de técnicas de biología molecular permiten establecer la presencia de mutaciones puntuales en el ADN, cuya aplicación en los tumores y lesiones preneoplásicas ha aportado valiosa información en el conocimiento de la progresión desde una célula genéticamente alterada hasta el desarrollo de una neoplasia1-4. En tumores malignos, como el retinoblastoma y el cáncer del colon5-10, esta información ha permitido precisar el rol de las mutaciones en la patogenia del cáncer y su aplicación en otras neoplasias ha alcanzado un notable desarrollo1,4,6,11-17.

En el cáncer de la vesícula biliar existe escasa información18-21, ya que no es un tumor de alta frecuencia en los países industrializados, a excepción de algunas áreas en Japón20,21 y porque el uso de técnicas de biología molecular es reciente en nuestro medio, limitándose sólo a estudios de expresión de algunos genes a nivel de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica18,19,22,23 y muy recientemente a nivel de gen19,24. El uso de la amplificación en cadena de ADN mediado por la polimerasa (PCR) ha sido fundamental para detectar mutaciones y otras anomalías, como pérdida de la heterozigocidad e inestabilidad microsatelital1,15,25-28.

El gen supresor de tumores p53 ha sido extensamente estudiado en otras neoplasias2,11-14,16,17,29-31, habiéndose establecido que la alteración que más frecuentemente compromete a este gen es la mutación puntual en lugares específicos (hot-spot), que, en más del 98% de los casos, afecta a los exones 5, 6, 7 y 829. Aún cuando la participación del gen p53 en la carcinogénesis parece ser más bien tardía, la presencia de alteraciones de este gen en lesiones preneoplásicas en un bajo porcentaje y su significativo aumento en las lesiones tumorales avanzadas ha permitido establecer una relación en la progresión displasia carcinoma in situ-carcinoma avanzado4,6,19,22,30. En el cáncer de la vesícula biliar la expresión inmunohistoquímica del producto proteico del gen p53 ha sido demostrada en 24% en los tumores incipientes y 48% en los avanzados, no observándose relación con el contenido de ADN22,23. Por otro lado, Yokoyama24, en 42 casos (grupo que incluyó a 20 casos del Hospital Sótero del Río), encontró 52,4% de alteraciones en los exones 5-8 del gen p53. En todos los casos de Chile se observó solo transiciones, a diferencia de los 22 casos de Niigata, Japón, en donde se observaron transiciones y tranversiones. Basado en esto los autores sugieren que existiría una diferencia regional en la génesis del cáncer de la vesícula biliar entre Chile y Japón.

El objetivo de este trabajo fue determinar la frecuencia de mutaciones en el cáncer de la vesícula biliar mediante secuenciación directa, correlacionándola con la expresión inmunohistoquímica (IHQ) del producto proteico del gen p53.

MATERIAL Y MÉTODO

Casos: se seleccionaron 36 carcinomas de la vesícula biliar del archivo de la Unidad de Anatomía Patológica-Citopatología del Hospital Temuco procesados de acuerdo a protocolos establecidos31. En todos el diagnóstico se realizó en la pieza de colecistectomía y el nivel de infiltración fue establecido mediante el estudio seriado de la totalidad de la vesícula biliar (mapeo total). Se seleccionaron áreas representativas de cada tumor, realizándose 5 cortes de 10 µ, que fueron almacenados para su procesamiento.

Obtención de las muestras: los cortes de cada uno de los casos fueron desparafinados en xilol e hidratados mediante incubaciones en concentraciones decrecientes de alcohol. Las baterías de procesamiento (solventes y colorantes) fueron montadas especialmente para esta técnica, a fin de disminuir los riesgos de contaminación. Los cuchillos del micrótomo fueron desechables, utilizando distintas áreas para cada muestra, previa limpieza con solventes. Se utilizó una placa teñida con hematoxilina-eosina y con IHQ para p53. Las muestras teñidas fueron observadas bajo microscopio invertido, sin cubreobjetos, y las áreas seleccionadas fueron microdisecadas mediante un microdisector hidráulico (Narishige) con la finalidad de enriquecer con células tumorales al material obtenido. Este material disecado, en cantidad variable según el caso (aproximadamente 2000 a 3000 células) fue colocado en un tubo de 1,5 ml con 1 ml de etanol absoluto. Posteriormente, se centrifugó a 12.000 rpm por 15 min a temperatura ambiente, eliminándose el sobrenadante y secándolo a temperatura ambiente.

Extracción del ADN: para la extracción de ADN se empleó el DNA Isolation Kif (Gentra USA), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, consistió en: incubación en solución de lisis con proteinasa K a 55° durante la noche o hasta la digestión del tejido. Luego, incubación con ARNasa y solución precipitante de proteínas. Del sobrenadante se precipitó el ADN con isopropanol; posteriormente se resuspendió en buffer de hidratación y almacenó a 4°C.

Amplificación del ADN: las amplificaciones fueron realizadas en un termociclador GeneAmp PCR Systems (Perkin Elmer). Se usaron 4 juegos de iniciadores (primers) para amplificar 4 segmentos de los exones 5, 6, 7 y 8 del gen supresor de tumores p53. La amplificación de estos 4 segmentos de tamaño entre 134 y 332 pares de bases se realizó usando las siguientes secuencias para los iniciadores32. Como control interno de la calidad del ADN extraído se realizó PCR para ß-globina.

Exón5 (sense) TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC 20 mer
240 bp (antisense) CTG GGC AAC CAG CCC TGT CGT 21 mer
Exón6 (sense) ACG ACA GGG CTG GTT GCC CA 20 mer
187bp (antisense) AGT TGC AAA CCA GAC CTC AG 20 mer
Exón7 (sense) TCT CCT AGG TTG GCT CTG ACT G 22 mer
134bp (antisense) GCA AGT GGC TCC TGA CCT GGA 21 mer
Exón8-9 (sense) CCT ATC CTG AGT AGT GGT AAT C 22 mer
332bp (antisense) CCC AAG ACT TAG TAC CTG AAG 21 mer
Bglobina (sense) CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 20 mer
260bp (antisense) ACA CAA CTG TGT TCACTA GC 20 mer


La PCR fue realizada con 5-10 µl de ADN genómico, 1 x buffer PCR, 0,2-0,4 µM de cada iniciador, 200 µM de cada uno de los deoxinucleótidos trifosfatos, 1,5 mM de MgCI y 1,5 U de Taq Polimerasa, en un volumen final de 50 µl (Gibco BRL). La amplificación se realizó con el siguiente protocolo: predenaturación (94° por 4 min), 35 ciclos de denaturación (94° por 1 min), hibridación y extensión ( 72° por 1 min). Las temperaturas de hibridación fueron para el exón 6 y 8 de 60° y para los exones 5 y 7 de 62° y de 55 para ß-globina por un tiempo de 1 min. La extensión final se realizó a 72º por 7 min.

Los productos PCR (pPCR) obtenidos fueron corridos en geles de agarosa 1,5%, 0,6µg/ml de bromuro de etidio y expuestos a luz UV (Fotodyne 21). En algunos casos se realizó una segunda amplificación en iguales condiciones, disminuyendo el número y duración de los ciclos (30 ciclos de 30 seg en cada paso). Esta reamplificación se realizó con 5-7 µI de pPCR.

Secuenciación de productos PCR: se secuenciaron los 4 exones 5, 6 7 y 8-9 del gen p53 en 25 de los 36 casos de cánceres vesiculares (69,4%). Los pPCR purificados fueron secuenciados directamente, usando el kit T7 Sequenase PCR product sequencing (Amersham) y 35S-dCTP marcado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, consistió en: tratar los pPCR con fosfatasa alcalina y exonucleasa para eliminar primers y hebras simples, posteriormente se agrego 1 µI de primer de secuencia (10µM) y la etapa de denaturación-hibridación se realizó a 95°C por 3 min. La marcación se realizó con 0,5 µCi de 35S-dCTP a temperatura ambiente por 10 min y la reacción de terminación se realizó a 37°C por 10 min. En los casos que presentaban mutaciones fueron confirmadas con secuenciación en ambos sentidos (sense y antisense).

Las muestras se corrieron en gel de polyacrilamida al 6% a 40 Watts y a una temperatura de 50°C por 2 h y posterior autoradiografía por alrededor de 17-20 h a temperatura ambiente.

Estudio inmunohistoquímico: se utilizó la técnica estándar Streptavidina-Biotina (Biogenex) para tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. Previo a la incubación del anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal anti-proteína p53 Oncogene Science Ab6 1:100), los cortes histológicos fueron calentados hasta ebullición y lavados con buffer fosfato. Posteriormente fueron incubados con anticuerpo secundario 1:320 (multilink biotinylated, Biogenex), durante una hora y finalmente revelados con diaminobenzidina. En cada prueba se emplearon controles negativos y positivos. En los controles negativos se sustituyó el anticuerpo primario por suero normal, y como control positivo se utilizaron casos de carcinomas del colon, en los que previamente se había demostrado positividad para esta oncoproteína.

Forma de medición de la positividad inmunohistoquímica: la tinción positiva para la proteína del gen p53 fue de tipo intranuclear (Figura 1). La estimación de la positividad se realizó de acuerdo al porcentaje de células positivas en la muestra examinada. Para los fines de este estudio se consideraron como positivos aquellos casos en que al menos 5% de las células mostraron positividad y se establecieron rangos de expresión según el porcentaje de células teñidas. En los casos con positividad dudosa, se realizó un nuevo ensayo, si persistía la duda estos casos fueron considerados negativos.

FIGURA 1. Microfotografía de adenocarcinoma tubular bien
diferenciado infiltrante en vesícula biliar con positividad
nuclear para p53 en aproximadamente 80% de los núcleos.

 

Figura 2. Secuenciación de los exones 5,6,7 y 8 del gen p53. Fotografía compuesta que muestra en el cuadrante superior derecho, área previa y posterior a la microdisección precisa de un carcinoma incipiente de la vesícula biliar. En los otros cuadrantes se reconocen ejemplos gráficos de mutaciones puntuales en los exones 5,6,7,8-9. Los asteriscos indican el cambio de nucleótido en relación al control normal. En el exon 8-9, se muestra la secuencia en dirección retrógrada (antisense) en el resto la dirección de secuencia es anterógrada (sense).

 

Análisis estadístico: se realizó mediante prueba de chi-cuadrado y prueba exacto de Fisher, con el software Epi 6.0

RESULTADOS

En 36 casos se logró amplificación de los 4 exones del gen p53. En uno de cada 5 casos el ADN extraído de las inclusiones de muestras fijadas en formalina e incluídas en parafina no se logró amplificación de todos los exones estudiado y en 25 de estos casos (69,4%) se logró secuenciar completamente los 4 exones en ambos sentidos (sense y antisense). Las características generales del grupo a estudiar (n = 25) se resumen en la Tabla 1. El 94% de los tumores eran adenocarcinomas, los que en su gran mayoría eran avanzados (89%) (con compromiso de la subserosa o serosa) y con un bajo grado de diferenciación histológica (moderadamente o poco diferenciados) (79%).

Tabla 1. Mutación del gen p53 en cáncer
vesícula biliar. Características del grupo
estudiado (n=25)

    n %

Sexo    
  Hombres 3 12
  Mujeres 22 88
Raza    
  Mapuche 8 32
  No mapuche 17 68
Edad (años) 59 (DS11,8)
Tipo Histológico    
  Adenocarcinoma 25 100
Grado de diferenciación    
  Bien 7 28
  Poco-moderado 18 72
Infiltración de la pared    
  Incipiente 4 16
  Avanzado 21 84

En 13 casos (52%) se observaron 17 mutaciones: 10 mutaciones puntuales por transición, 5 por transversión, 1 inserción (codón 194) y una deleción (codón 186). En la Tabla 2 se resumen los hallazgos de los 13 casos, que incluye al codón en el cual se encontró la lesión, el cambio de nucleótido y la modificación de la secuencia aminoacídica. Las mutaciones se distribuyeron de la siguiente manera: E 5= 8 casos; E 6= 6 casos; E 7= 2 casos y E 8-9= 1 caso. En dos casos (7 y 12) se encontró una mutación silente, la que no fue demostrada en el tejido normal adyacente. En el caso 13 se encontró una inserción entre el codón 193 y 194 la cual modificó la secuencia aminoacídica entre los codones 194 y 207, luego de la cual aparece un codón de terminación (codón 208).

Tabla 2. Mutación del gen p53 en cáncer vesícula biliar. Resultados de la secuenciación

Caso nº caso años infil exon codon Nucleótido cambio tipo
            Sustituído aminoácido cambio

1 4 74 A 5 175 CGC-CAC arg-his transición
2 5 70 I 5 186 GAT-*AT Cml** deleción
3 7 75 A 5 167 CAG-CAT gln-his transversión
  7     5 168 CAC-GAC his-asp transversión
  7     5 178 CAC-CTC his-leu transversion
4 8 59 I 7 248 CGG-TGG arg-trp transición
5 13 60 A 6 195 ATC-ACC ile-thr transición
  13     6 205 TAT-TCT tyr-ser transversión
6 14 43 A 8-9 306 CGA-TGA codon stop transición
7 15 64 I 6 213 CGA-CGG arg-arg (ms) transición
8 16     5 173 GTG-GCG val-ala transición
9 17 54 A 7 242 GGC-AGC gly-ser transicion
10 18 63 A 5 136 CAA-CAC gln-his transversión
  18     5 173 GTG-GCG val-ala transición
11 29 62 A 6 213 CGA-CAG arg-gln transición
12 22 43 A 6 194 CTT-CTC leu-leu (ms) transición
13 34 65 A 6 194 CTT-©CTT& Cml** inserción

©inserción de una Citosina.
& En el codón 208 se genera un codón de detención.
* Deleción de una Guanidina
** Cml Cambio del marco de lectura

De aquellos casos que presentaban mutación, tres eran carcinomas incipientes y los 10 restantes avanzados; las diferencias observadas no son significativas, pero si se observó una tendencia a mutaciones múltiples en los casos de carcinomas avanzados (3 casos).

En 14 de los 25 casos (56%) el estudio inmunohistoquímico mostró positividad para la expresión de la proteína de este gen. Se establecieron rangos según porcentaje de células positivas como se muestra en la Tabla 3. Al considerar los casos con más de 20% de sus células positivas, se encontró una correlación entre la alteración génica (mutación) y la expresión inmunohistoquímica de la proteína en el 82% de los casos (Tabla 4) (sensibilidad= 81,8%, especificidad= 83,3%, valor predictivo positivo= 81,8%, y negativo= 83,3%). En la correlación inmunohistoquímica-secuenciación, se excluyeron 2 casos (casos 7 y 12) con inmunohistoquímica (-) y secuencia (+), debido a que en ambos se trataba de una mutación silente, en la cual no existe cambio de la secuencia aminoacídica de la proteína, por lo tanto sin modificación de su actividad biológica, haciéndola indetectable mediante está técnica.

Tabla 3. Inmunohistoquímica para p53
según porcentaje de células teñidas

% células positivas Número de casos n=25

0-5 11
6-20 2
21-50 4
>50 8

 

Tabla 4. Correlación entre
Inmunohistoquímica para p53 y secuencia

  Mutación Mutación
  + (Seq.) - (Seq)

Inmunohistoquímica (+) 10 2
(> 20%) 1 (*) 10
Inmunohistoquímica (-)    
(<20%)    

P<0,001
(*) 2 casos con mutaciones silentes fueron excluidos

Dado el escaso número de casos no fue posible establecer una relación entre algunas variables morfológicas del tumor, tales como tipo macroscópico, grado de diferenciación histológica y nivel de infiltración del tumor y la presencia de mutación.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran la presencia de mutaciones puntuales en el 52% de los carcinomas vesiculares en los que fue posible la amplificación y secuenciación de los 4 exones estudiados. Aún cuando el número de casos es insuficiente para establecer una clara relación con algunas características del tumor, se muestran como una alternativa para el estudio y caracterización de esta neoplasia a nivel molecular. Los hallazgos en otras neoplasias en este mismo campo son alentadores, respecto del grado de conocimiento que se ha alcanzado en el estudio de la carcinogénesis, especialmente en tumores de la mama y el colon.

En el cáncer de la vesícula biliar, algunos estudios muestran expresión de la proteína del gen p53 en porcentajes que varían desde 35% a 65% (Ajiki 39,6%)20, (Roa 51%)23, (Wistuba 65,4%)18, observándose mayor positividad en los tumores avanzados que en los incipientes y un aumento progresivo de la expresión desde lesiones displásicas, carcinoma in situ y carcinoma invasor19. Por otro lado, son escasos los estudios que muestran la presencia de un desbalance alélico del gen p53 en el cáncer vesicular19,21,33-37. La pérdida de la heterozigocidad de los alelos del gen p53 ya ha sido demostrada en el cáncer vesicular, en el 91% de los casos, y en ese estudio precedió a la expresión inmunohistoquímica de la proteína producida por este gen19. Sólo escasas comunicaciones mencionan la presencia de mutación del gen p53 en el cáncer vesicular, demostrada mediante secuenciación directa con una frecuencia que va desde el 29% al 70% en las respectivas series21,35,38-40.

Al igual que lo comunicado por autores japoneses24, nuestros casos presentan transiciones y transversiones, hallazgo interesante si se considera que en este trabajo se incluyeron pacientes chilenos, grupo en el cual sólo se demostraron mutaciones del tipo transición. Este hallazgo indujo a los autores a plantear una vía carcinogenética distinta entre el cáncer vesicular entre Chile y Japón. Sin embargo, nuestros hallazgos no avalan dicha hipótesis. De igual modo la presencia de transversiones no guardó relación con el origen mapuche de los pacientes.

Nuestros resultados muestran una correlación superior al 80% entre la expresión inmunohistoquímica de p53 y una mutación detectada mediante secuenciación directa. Existen numerosas causas para explicar los falsos positivos y negativos de la inmunohistoquímica si se considera a la secuenciación como técnica de referencia. Los falsos positivos pueden deberse a la estabilización de la proteína p53 por otras proteínas, como algunos productos virales (E6-E7 del virus papiloma humano), o bién, la mutación podría estar en alguno de los exones no estudiados, siendo esto poco probable si consideramos más del 98% las mutaciones del gen p53 en otras neoplasias se encuentran entre los exones 5 y 9. Los falsos negativos pueden deberse a mutaciones puntuales que no estabilicen la vida media de la proteina (sin cambio de la secuencia aminoacídica) o no modifiquen específicamente el sitio de reconocimiento antígeno-anticuerpo. Este fenómeno es probablemente el ocurrido en 2 de nuestros casos, los cuales fueron excluídos en el análisis de correlación entre inmunohistoquímica y secuencia. Sin embargo, se debe considerar que probablemente este cambio en la secuencia nucleotídica del gen no conlleva un cambio en su actividad biológica. Por otro lado, una mutación de detención puede hacer desaparecer una parte importante de la proteína haciéndola indetectable a la inmunohistoquímica.

La gran frecuencia en la alteración del gen p53 en casos incipientes y avanzados de cáncer de la vesicula biliar apoya su importancia en la carcinogénesis vesicular. A su vez, la alta sensibilidad y especificidad de la inmunohistoquímica permite considerarla como un excelente herramienta de apoyo en la detección de mutaciones puntuales del gen p53, especialmente cuando ésta se encuentra presente en más del 20% de las células tumorales.

La importancia de estos hallazgos deberá evaluarse a la luz de un mayor número de observaciones, cuyo estudio recién esta comenzando en nuestro medio. El estudio de poblaciones celulares de alta pureza, obtenidas mediante microdisección, permitirá precisar alteraciones que preceden a la aparición de un cáncer vesicular y de esta manera comprender mejor los mecanismos involucrados en la génesis de esta importante enfermedad.

Correspondencia a: Dr. Iván Roa. Casilla 54-D, Facultad de Medicina, Universidad de la Frontera, Temuco-Chile.

REFERENCIAS

1. EGUCHI S, KOHARA N, KOMUTA K, KANEMATSU T. Mutations of the p53 gene in the stool of patients with resectable colorectal cancer. Cancer 1996; 77: 1707-10.        [ Links ]

2. OCHIAI A, YARMAUCHI Y, HIROHASHI S. p53 mutations in the non-neoplastic mucosa of the human stomach showing intestinal metaplasia. Int J Cancer 1996; 69: 28-33.        [ Links ]

3. MURASE T, NIWA K, MORISHITA S, ITOH N, MORI H, TANAKA T, TAMAYA T. Rare occurrence of p53 and ras gene mutations in preneoplastic and neoplastic mouse endometrial lesions induced by N-methyl-N-nitrosourea and 17 betaestradiol. Cancer 1995; 92: 223-7.        [ Links ]

4. TRUDEL M, MULLIGAN L, CAVENEE W, MARGOLESE R, COTE J, GARIEPY G. Retinoblastoma and p53 gene product expression in breast carcinoma: immunohistochemical analysis and clinicopathologic correlation. Hum Pathol 1992; 23: 1388-94.        [ Links ]

5. HOLLSTEIN M, SIDRANSKY D, VOGELSTEIN B, HARRIS C. p53 mutation in human cancers. Science 1991; 253: 49-53.        [ Links ]

6. HASEGAWA H, UEDA M, FURUKAWA K, WATANABE M, TERAMOTO T, MUKAI M, KITAJIMA M. p53 gene mutations in early colorectal carcinoma. De novo vs adenoma-carcinoma sequence. Int J Cancer 1995; 64: 47-51.        [ Links ]

7. CARDER P, CRIPPS K, MORRIS R, COLLINS S, WHITE S, BIRD C, WYLLIE A. Mutation of the p53 gene precedes aneuploid clonal divergence in colorectal carcinoma. Br J Cancer 1995; 71: 215-8.        [ Links ]

8. DOBBIE Z, SPYCHER M, HURLIMAN R, AMMANN R, AMMANN T, ROTH J ET AL. Mutational analysis of the first 14 exons of the adenomatous polyposis coli (APC) gene. Eur J Cancer 1994; 30A: 1709-13.        [ Links ]

9. KASTRINAKIS W, RAMCHURREN N, RIEGER K, HESS D, LODA MM, STEELE G, SUMMERHAYES I. Increased incidence of p53 mutations is associated with hepatic metastasis in colorectal neoplastic progression. Oncogene 1995; 11: 647-52.        [ Links ]

10. SUZUI M, YOSHIMI N, USHIJIMA T, HIROSE Y, MAKITA H, WANG A ET AL. No involvement of Ki-ras or p53 gene mutations in colitis-associated rat colon tumors induced by 1-hydroxyanthraquinone and methylazoxymethanol acetate. Mol Carcinog 1995; 12: 193-7.        [ Links ]

11. GUINN B, SMITH M, PADUA R, BURNETT A, MILLS K. Changing p53 mutations with the evolution of chronic myeloid leukaemia from the chronic phase to blast crisis. Leuk Res 1995; 19: 519-25.        [ Links ]

12. SHI C, PHANG T, NGOI S, WEE A, LI B, LIN Y ET AL. Characterization of p53 gene mutations in colorectal carcinomas from an Asian population. Anticancer Res 1994; 14: 2811-6.        [ Links ]

13. HAYASHI H, SUGIO K, MATSUMATA T, ADACHI E, TAKENAKA K, SUGIMACHI K. The clinical significance of p53 gene mutation in hepatocellular carcinomas from Japan. Hepatology 1995; 22: 1702-7.        [ Links ]

14. MARTÍNEZ DELGADO B, ROBLEDO M, ARRANZ E, RIVAS C, BENÍTEZ J. Characterization of mutation of the P53 gene in Iymphomas. Sangre Barcelona 1995; 40: 301-5.        [ Links ]

15. SHEKHAR P, WERDELL J, CHRISTMAN J, MILLER F. Heterogeneity in p53 mutations in mouse mammary tumor subpopulations with different metastatic potential from the orthotopic site. Anticancer Res 1995; 15: 815-20.        [ Links ]

16. PATEL UA, PERRY M, CRANE ROBINSON C. Screening for germline mutations of the p53 gene in familial breast cancer patients. Eur J Clin Invest 1995; 25: 132-7.        [ Links ]

17. NISHIMURA S, ASOU N, SUZUSHIMA H, OKUBO T, FUJIMOTO T, OSATO M ET AL. p53 gene mutation and loss of heterozygosity are associated with increased risk of disease progression in adult T cell leukemia. Leukemia 1995; 9: 598-604.        [ Links ]

18. WISTUBA I, GAZDAR A, SUGIO K, ROA I, AND ALBORES-SAAVEDRA J. p53 Protein over-expression in Gallbladder Carcinoma and its Precursor Lesions. Human Pathol 1966; 27: 360-5.        [ Links ]

19. WISTUBA I, SUGIO K, HUNG J, KISHIMOTO Y, VIRMANI A, ROA I ET AL. Allele specific mutations involved in the pathogenesis of endemic gallbladder carcinoma in Chile. Cancer Research 1995; 55: 2511-5.        [ Links ]

20. AJIKI T, ONOYAMA H, YAMAMOTO M, ASAKA K, FUJIMORI T, MAEDA S, SAITOH Y. p53 protein expression and prognosis in gallbladder carcinoma and premalignant lesions. Hepatogastroenterology 1996; 43: 521-6.        [ Links ]

21. TAKAGI S, NAITO E, YAMANOUCHI H, OHTSUKA R, KOMINAMI R, YAMAMOTO M. Mutation of the p53 gene in gallbladde cancer. Tohoku J Exp Med 1994; 172: 283-9.        [ Links ]

22. ROA I, VILLASECA M, ARAYA J, ROA J, ARETXABALA X, MELO A, IBACACHE G. p53 tumour suppressor gene protein expression in early and advanced gallbladder carcinoma. Histopathology 1997; 31: 226-30.        [ Links ]

23. ROA I, VILLASECA M, ARAYA J, ROA J, ARETXABALA X, FUENTEALBA P, MELO A ET AL. DNA ploidy pattern and tumor suppressor gene p53 expression in gallbladder carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1997; &: 547-50.        [ Links ]

24. YOKOYAMA N, HITOMI J, WATANABE H, AJIOKA Y, PRUYAS M, SERRA I, SHIRAI Y, HATAKEYAMA K. Mutations of p53 in gallbladder carcinoma in High-lncidence areas of Japan and Chile. Cancer Epidemiol Biom Prev 1998; 7: 297-301.        [ Links ]

25. PCR PROTOCOLS. Methods in Molecular Pathology. Volume 15. Edited White B. Humana Press New Jersey 1993.        [ Links ]

26. PENG H, DU M, JI J, ISAACSON PG, PAN L. High-resolution SSCP analysis using polyacrylamide agarose composite gel and a background-free silver staining method. Biotechniques 1995; 19: 410-4.        [ Links ]

27. CHEN Y, LI C, YAP E, MCGEE J. Detection of loss of heterozygosity of p53 gene in paraffin-embedded breast cancers by non-isotopic PCR-SSCP. J Pathol 1995; 177: 129-34.        [ Links ]

28. OZCELIK H, ANDRULIS IL. Multiplex PCR-SSCP for simultaneous screening for mutations in several exons of p53. Biotechniques 1995; 18: 742-4.        [ Links ]

29. VOGELSTEIN B, KINZLER K. p53 function and dysfunction. Cell 1992; 70: 523-6.        [ Links ]

30. Diagnostic Molecular Pathology. A practical Approach. Volume II. Edited Herrington C. The Practical Aproach series. Oxford University Press U.K 1992.        [ Links ]

31. ROA I, ARAYA J, WISTUBA I, VILLASECA M, DE ARETXABALA XCáncer en la vesícula biliar en la IX Región de Chile. Estudio morfológico en 474 casos. Rev. Méd. Chile 1994; 122: 1248-56.        [ Links ]

32. BUETOW K. Low frequency of p53 mutations observed in a diverse collection of primary hepatocelluar carcinomas. PNAS 1992; 89: 9622-6.        [ Links ]

33. HANADA K, ITOH M, FUJII K, TSUCHIDA A, OOISHI H, KAJIYAMA G. K-ras and p53 mutations in stage I Gallbladder Carcinoma with an anomalous junction of the pancreaticobiliary duct. Cancer 1996; 77: 452-8.        [ Links ]

34. AJIKI T, ONOYAMA H, YAMAMOTO M, ASAKA K, FUJIMORI T, MAEDA S, SAITOH Y. p53 protein expression and prognosis in gallbladder carcinoma and premalignant lesions. Hepatogastroenterology 1996; 43: 521-6.        [ Links ]

35. MALATS N, PORTA M, PINOL JL, COROMINAS JM, RIFA J, REAL FX. Ki-ras mutations as a prognostic factor in extrahepatic bile system cancer. PANK-ras I Project Investigators. J Clin Oncol 1995; 13: 1679-86.        [ Links ]

36. YOSHIDA S, TODOROKI T, ICHIKAWA Y, HANAI S, SUZUKI H, HORI M, FUKAO K, MIWA M, UCHIDA K. Mutations of p16Ink4/CDKN2 and p15Ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers. Cancer Res 1995; 55: 2756-60.        [ Links ]

37. ITOI T, WATANABE H, AJIOKA Y, OOHASHI Y, TAKEL K, NISHIKURA K, NAKAMURA Y, HORIL A, SAITO T. APC, K-ras codon 12 mutations and p53 gene expression in carcinoma and adenoma of the gallbladder suggest two genetic pathways in gallbladder carcinogenesis. Pathol Int 1996; 46: 333-40.        [ Links ]

38. HANADA K, ITOH M, FUJII K, TSUCHIDA A, HIRATA M, IWAO T ET AL. TP53 mutations in stage I gallbladder carcinoma with special attention to growth patterns. Eur J Cancer 1997; 33: 1136-40.        [ Links ]

39. FUJII K, YOKOZAKI H, YASUI W, KUNIYASU H, HIRATA M, KAJIYAMA G, TAHARA E. High frequency of p53 gene mutation in adenocarcinomas of the gallbladder. Cancer Epidemiol Biomarkers 1996; 5: 461-6.        [ Links ]

40. JONAS S, SPRINGMEIER G, TAUBER R, WIEDENMANN B, GRESSNER R, KLING N. p53 hot-spot mutational analysis in advanced Western gallbladder carcinoma. World J Surg 1997; 21:768-72.        [ Links ]