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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.127 n.11 Santiago nov. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98871999001100014 

ARTÍCULO DE REVISIÓN

Aspectos que afectan el análisis
de contenido de ADN por
citometría de flujo

Factors that affect DNA content
analysis by flow cytometry

Juan L Castillo N1, Fernando Kawaguchi P,
Jaime Madariaga B, Oscar Venegas R, Eduardo Lecannelier F,
Sandor Ocampo R, Marcelo Castillo N1,2

DNA ploidycell cycle analysis by flow cytometry is used to obtain additional information about the diagnosisprognosis of different types of cancer. However, there are several disagreements among authors about the tissue source (fresh-frozen or paraffin embedded), cellular dissociation methods (mechanical, enzymatic or other), use of different dyes, lasers, analysis software with different mathematical modelsinterpretation of results. A discussion about the different aspects that affect the study of DNA ploidycell cyclea consensus in publications is mandatory. A strict control of analysis processesdata interpretation is also necessary.
(Key Words: Cell Cycle; Cytological Techniques; DNA; Ploidies)

Recibido el 1 de marzo, 1999. Aceptado en versión corregida el 22 de julio, 1999.
Laboratorio de Citometría de Flujo, Hospital del Trabajador, Concepción.
Facultad de Medicina, Universidad de Concepción, Chile.
1 Tecnólogo Médico
2 Licenciado en Tecnología Médica

La citometría de flujo es una tecnología que permite medir los más diversos parámetros celulares como antígenos de superficie, citoplasmáticos y nucleares, contenido de ácidos nucleicos, actividad enzimática, flujo de calcio, potencial de membrana y pH entre otros1.

El principio básico de la citometría de flujo es la medición de un gran número de células, en forma individual, en un período muy corto de tiempo mientras se desplazan en un sistema de flujo o torrente líquido (100-25.000 células por segundo en sangre periférica u otros líquidos corporales). Cada célula pasa por un punto donde son impactadas por un láser, que emite fluorescencia a una longitud que depende de cada tipo de láser, y cuya luz es desviada o alterada de acuerdo a características propias de cada célula. La variación de la longitud de onda así producida, es captada y depurada por un complejo sistema de lentes y espejos especiales, que concentra esta luz y la transforma en pulsos de voltaje. Estos son codificados e interpretados por un computador provisto del programa adecuado. Los datos obtenidos de esta manera pueden manejarse muy versátilmente, siendo de gran confiabilidad y exactitud.

Si además a estas células se les acoplan moléculas fluorescentes, que son excitadas y alteradas por el láser, emitiendo una respuesta fluorescente en una longitud de onda mayor, lo que facilita la identificación de subgrupos específicos dentro de las grandes poblaciones celulares1. Estas moléculas fluorescentes pueden estar acopladas a anticuerpos monoclonales específicos o en solución.

Utilizando flourocromos en solución, capaces de unirse estequiométricamente al ADN y ARN de las células, intercalándose en la doble hebra de ácidos nucleicos (yoduro de propidio, bromuro de etdio, acridin orange, DAPI, etc), es posible evaluar el contenido de ADN y las diferentes fases del ciclo celular1.

DEFINICIONES Y EXPLICACIÓN DE TÉRMINOS

Contenido de ADN y ciclo celular. La determinación de ploidía de ADN y del ciclo celular por citometría de flujo se ha realizado por más de dos décadas, demostrando que los cambios en el contenido de ADN celular se presentan comúnmente en diversos tipos de cáncer1-3. Las células marcadas con un fluorocromo, que se une estequiométricamente a los ácidos nucleicos, emiten fluorescencia proporcional al contenido cromosómico global. De esta manera se produce un patrón característico que refleja las fases del ciclo celular dentro de la población de células en estudio1.

El ciclo celular puede reflejarse en una curva que muestre las variaciones del contenido de ADN versus el número de células analizadas1. La fluorescencia medida en las células en fase de reposo (G0) y en fase de presíntesis de ADN (G1), produce un pico con distribución normal4. De la misma forma, las células en G2, que tienen duplicado su ADN con respecto a las células en G1, también producen un pico distribuido como una normal. Los mismos factores que afectan la amplitud de los picos G0G1 y G2M, también afectan la amplitud de la fase S, por lo que en un histograma de ADN, las células que inician la fase S se superponen con las células G1, como también lo hacen las células al final de la fase S con las células en G23. EI término coeficiente de variación (CV) describe la amplitud o ancho de la curva (CV= 100 x SD/media del pico)4.

Las células normales tienen un número 2n de cromosomas, es decir son diploides. Un número anormal de cromosomas, característicos de células tumorales, se denomina aneuplodía y refleja cambios en el contenido de ADN1.

El contenido de ADN de una población celular se expresa como el índice de ADN, el cual se define como la razón entre el contenido de ADN de la población celular en estudio con respecto a células normales o células control28. En muchos tumores humanos la ploidía representa un factor pronóstico1,5-13.

El mayor obstáculo para una amplia aplicación clínica de las mediciones del contenido de ADN, ha sido la falta de concordancia entre diversos estudios3, existiendo diferencias en la técnica utilizada en la preparación de los diversos tipos de tejidos analizados, la fuente de luz de los citómetros (tipo de láser), el número de núcleos o células a medir, y en los métodos de análisis e interpretación de los histogramas de ADN5,6,14,15. Dentro de los diversos aspectos ya mencionados, se destacan:

Obtención de una muestra de tejido representativo. Es el primer paso para el estudio de contenido de ADN por citometría de flujo. Independiente de la fuente, la muestra de tejido debe ser evaluada por personas calificadas (patólogo, citólogo, hematólogo), para constatar que contenga material neoplásico adecuado para el estudio citométrico3.

Tipo de tejido. Utilizando la citometría de flujo es posible analizar el contenido de ADN tanto de células frescas o criopreservadas (sangre periférica, médula ósea, suspenciones celulares, etc.)14-16 así como también tejidos sólidos fijados e incluidos en parafina1. En este último caso son determinantes las condiciones de fijación del tejido y el tiempo que permanece el tejido en el fijador, antes de ser embebido en parafina.

Protocolos de disgregación celular. El primer paso en la preparación de una muestra de tejido fresco (o criopreservado)14-16, es la disociación del mismo, es decir, poder obtener una suspensión de células individuales. Para lograr este objetivo, se utilizan diversas metodologías (disociación mecánica, enzimática, química o quelación y enucleación con detergentes). Dentro de las más utilizadas se encuentra la disociación mecánica y la enzimática.

La disociación mecánica es útil para obtener en forma fácil una suspensión celular a partir de tejidos fácilmente disociables, como es el caso de nódulos linfáticos, bazo, timo y colon. Basta para ello cortar el tejido con un bisturí en pequeños trozos y luego agitarlos en suspensión mediante vórtex.

La disociación enzimática se usa comúnmente para estudios que requieren un alto número de células viables, utilizándose proteasas no específicas y específicas, enzimas hidrolíticas, etc, siendo la pepsina una de las enzimas más utilizadas. Este procedimiento presenta como desventaja la pérdida de marcadores celulares de superficie y en el caso de suspensiones nucleares también se pierden los marcadores citoplasmáticos17.

En el caso de tejidos fijados e incluidos en parafina, la base de los diversos protocolos de preparación de tejidos y de disgregación celular tienen como base la técnica original propuesta por Hedley et al18 en 1983, en la que se ocupan secciones rehidratadas en forma secuencial, seguido de una digestión enzimática con pepsina 0,5% pH 1,5 por 30 min a 37°C4,11,17,19,20. Se han descrito muchas variaciones a la técnica original4,17,19, desgraciadamente no siempre se mide adecuadamente el impacto de estas modificaciones sobre los resultados de un análisis de ADN17.

Definición de controles (repetido). Un desafío del análisis de contenido de ADN y ciclo celular por citometría de flujo de tumores sólidos, lo constituye la definición de control normal. En condiciones ideales se debe usar como control un tejido histológicamente normal, sometido a idénticas condiciones que el tejido a analizar. Al respecto, es necesario considerar (tanto para tejido fresco, como para tejidos en parafina), lo inusual de un tejido con células aneuploides que no presente al menos un pequeño componente de células diploides (células, estromales, endoteliales, etc), lo que permite establecer el pico diploide (G0G1), es decir establecer un control interno. En el caso de poblaciones celulares histológicamente homogéneas se debe considerar la posibilidad de ocupar un control externo o estándar4,11.

Tipos de fluorocromo y citómetros de flujo utilizados. En el análisis de ácidos nucleicos es posible utilizar diversos tipos fluorocromos, dependiendo de su espectro de emisión y fundamentalmente del tipo de láser con que esté equipado el citómetro de flujo a usar21. Generalmente se usa yoduro de propidio, excitándolo con un láser de Argón que emite luz a 488 nm. Este tipo de láser es el que traen incorporado la mayoría de los citómetros de flujo disponibles, existiendo citómetros de flujo con más de un tipo de láser21-23.

Análisis de histogramas de ADN. Para efectuar un análisis de un histograma de ADN, se encuentran comercialmente disponibles diversos programas computacionales, los que eventualmente utilizan diferentes modelos matemáticos para estimar las fases del ciclo celular6,14,15,24-27.

Se han descrito diversos modelos matemáticos para estimar la fracción proliferativa o fase S y demás componentes de un histograma de ADN (Debris y agregados), los más utilizados son los modelos rectangular, trapezoidal y polinomial:

Modelo rectangular: Es el modelo más conservativo para modelar y estimar el componente fase S, es decir, pequeñas perturbaciones en la forma de la fase S, tendrán un impacto relativamente pequeño sobre el área de estimación de ésta24. Es el modelo de elección para histogramas de ADN generados de tumores sólidos, permitiendo el uso de más de un compartimiento para modelar y estimar la fase S24,25.

Modelo trapezoidal: También es relativamente conservador para estimar el componente fase S24-27. A diferencia del modelo rectangular, el modelo trapezoidal es una representación más realista de la fase S, tiene un grado de libertad adicional y generalmente entrega valores de fase S mayores, y al igual que el modelo rectangular, los límites y desviaciones estándares son determinadas por los picos a ambos lados del modelo14,25.

Modelo polinomial: Tiene un grado de libertad adicional, sobre el modelo trapezoidal y debe ser usado con precaución25. Puede tomar numerosas formas debido a sus tres grados de libertad, siendo de elección para histogramas que funcionan bien, como es el caso de cultivos de líneas celulares24.

También existen modelos destinados a compensar la presencia de debris y agregados en el histograma y su efecto sobre el modelo de análisis completo, y los resultados del ciclo celular.

Debris: Casi todas las suspensiones celulares o nucleares analizadas en su contenido de ADN por citometría de flujo, contienen algo de núcleos fragmentados, lo que se traduce en debris, un componente adicional del histograma, visible a la izquierda del pico G0G1. Existen varias formas de corregir el debris6:

Distribución single-cut: Es aplicable a material embebido en parafina24,25.

Distribución multi-cut: Es recomendada para preparaciones de tejido fresco, aunque no se aprecie debris en forma visual24,25.

Agregados: En la mayoría de los histogramas de ADN una cuidadosa inspección revelará la presencia de agregación celular, dobletes de células G0G1 serán interpretadas como el pico G2M (y éste será sobrestimado).

VARIABLES QUE INFLUYEN
EN EL ANÁLISIS DE ADN Y CICLO CELULAR

Desde que David Hedley18, en 1983 publicó el primer estudio de contenido de ADN por citometría de flujo, son muchas las revisiones y modificaciones efectuadas a la técnica original, no siempre dimensionando adecuadamente el impacto de estas modificaciones sobre los resultados de un análisis de contenido de ADN4,11,17,19,20, como consecuencia de lo anterior no es extraño encontrar publicaciones contradictorias en cuanto a resultados y conclusiones. Al respecto claramente se aprecian dos limitantes para lograr una concordancia entre diferentes laboratorios en lo que se refiere a determinación de contenido de ADN:

1) La falta de valores de puntos de corte para un estado determinado de una patología, que faciliten la comparación de informes de otros laboratorios3, de gran importancia cuando se considera que muchos tipos de cáncer (mamario, gástrico, etc) son estructuralmente heterogéneos (Figura 1), presentando distintas poblaciones tumorales cada una con su ciclo celular particular5,12.

.
FIGURA 1. Heterogeneidad tumoral en carcinoma gástrico avanzado. Resultados Personales. Areas seleccionadas y representativas de tumor, provenientes de una gastrectomía total, son fijadas en formalina e incluidas en parafina. De un bloque de parafina se efectúan 2 cortes consecutivos de 50 µm de espesor (1A y 1B), los que son procesados según método de Hedley modificado17,18,22. Brevemente: los cortes se desparafinizan e hidratan progresivamente para finalmente ser digeridos enzimáticamente con pepsina 0,5% a pH 1,5 por 30 min a 37ºC, con agitación vórtex cada 5 min. Una vez disgregadas las células, se adiciona tripsina y RNAsa, para finalmente teñir núcleos con yoduro de propidio (Cycle Test DNA Reagent Kit, BD). La adquisición se realiza en Citómetro de Flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, BD) con software CELL Quest V 3.1 f, previa calibración con eritrocitos de pollo y timocitos de carnero (DNA QC, BD). Se adquiere un mínimo de 20.000 eventos. El análisis se efectúa en Software Modfit LT, modelando fase S en forma rectangular con 3 compartimientos, debris y agregados. Como son zonas de tejido seleccionado, no hay presencia de células normales detectables, por lo que en histograma A se aprecian 3 poblaciones celulares aneuploides diferentes (gris oscuro, trama de puntos y negro respectivamente) con índice de ADN de 1,5, 1,7 y 2,2 respectivamente. En histograma B, que es un corte siguiente al anterior, sólo se detectan 2 poblaciones celulares aneuploides (gris oscuro y trama de puntos) con índice de ADN de 1,7 y 2,2 lo que concuerda con las poblaciones celulares aneuploides 2 y 3 de histograma A. Debris se representa en gris claro y agregados en achurado vertical.

2) El uso de diferentes procedimientos de selección, preparación y marcación de tejidos, como también el uso de distintos programas computacionales de análisis y en consecuencia la utilización de diferentes modelos matemáticos para la estimación de las diferentes etapas del ciclo celular, especialmente la fase S3,4,6,14,15,24.

Como consecuencia de lo anterior, se hace necesario discutir detalladamente algunos de los aspectos ya expuestos y que necesariamente se deben considerar al momento de efectuar un análisis de contenido de ADN.

Obtención de una muestra de tejido representativo. Ya se mencionó la necesidad de evaluación y certificación histológica de toda muestra de tejido, con el objetivo de constatar la presencia de material neoplásico adecuado3. Una buena alternativa y que en nuestra experiencia ha dado excelentes resultados, es la observación al microscopio óptico de un extendido de la suspensión celular obtenida, posterior a la disgregación del tejido y previo al marcaje de ADN, ya sea usando tejidos frescos o tejidos incluidos en parafina. La ventaja se manifiesta cuando se trabaja un tejido fresco de dimensiones pequeñas (por ejemplo, una biopsia endoscópica con el fin de evaluar lesiones malignas y premalignas del tracto gastrointestinal), donde esta evaluación microscópica certifica la calidad del material a evaluar, junto con proporcionar al patólogo una orientación más acabada del proceso histológico involucrado, ya que biopsias con propósito diagnóstico, pueden sólo "muestrear" una porción limitada de la lesión7,17,28,29. El poder "muestrear" múltiples sitios, minimiza el impacto de poblaciones celulares tumorales heterogéneas, lo que es especialmente importante en el caso de sarcomas8 y carcinomas de ovario y mama17, colon28, esófago17, pulmón30, vejiga17 y gástrico9.

En la Figura 1 se muestran resultados personales que ejemplifican el concepto de heterogeneidad tumoral en un carcinoma gástrico avanzado, el cual presenta claramente distintas poblaciones aneuploides o tumorales. De un bloque de parafina se efectúan 2 cortes consecutivos de 50 µm de espesor (1-A y 1-B), los que son procesados según método de Hedley modificado11,18,19. Como son zonas de tejido seleccionado, no hay presencia de células normales detectables, por lo que en histograma A se aprecian 3 poblaciones celulares aneuploides diferentes (gris oscuro, trama de puntos y negro respectivamente) con índice de ADN de 1,5, 1,7 y 2,2 respectivamente. En histograma 1-B, que es un corte siguiente al anterior, sólo se detectan 2 poblaciones celulares aneuploides (gris oscuro y trama de puntos) con índice de ADN de 1,7 y 2,2.

Tipo de tejido. Referente al tipo de tejido a analizar para contenido de ADN por citometría de flujo, el uso de tejido fresco presenta varias ventajas sobre el tejido fijado, entre las que se encuentra la obtención de una fase S más realista, producto de una menor cantidad de debris, conservándose indemnes estructuras celulares tanto de superficie como citoplasmáticas que permiten realizar estudios inmunofenotípicos, es decir de marcación inmunológica17. La desventaja del uso de tejido fresco es la necesidad de procesamiento inmediato, es decir antes de 2 a 3 h (dependiendo del tipo de tejido) posterior a la obtención de la muestra. Si bien existen protocolos de criopreservación celular (a -80°C) para estas muestras, no siempre se cuenta con esta posibilidad.

El uso de tejidos incluidos en bloques de parafina ha facilitado la determinación en forma retrospectiva del contenido de ADN y parámetros de proliferación celular en grupos de pacientes bien definidos con curso clínico conocido, pudiéndose determinar el valor predictivo o significación pronóstica de dichas mediciones para cada grupo de pacientes3,9-11,17,19. Además de poder obtenerse resultados comparables a tejido fresco, el uso de bloques de parafina permite la identificación histológica de la muestra, sin olvidar que es un medio estable y económico de almacenamiento11. Por otro lado, se tiene la ventaja (con respecto al tejido fresco) de seleccionar la región del tejido que es de interés, mediante la simple y cuidadosa observación de una lámina teñida, identificándose así las regiones del tejido a eliminar o conservar según sea el caso11,17,19.

Los histogramas de análisis de ADN derivados de material incluido en parafina, se caracterizan por tener coeficientes de variación amplios y una cantidad de debris aumentada3,17, atribuible a la fijación de la muestra, proceso crítico en los resultados a obtener. La fijación afecta significativamente la intensidad de marcaje del ADN y la marcación de proteínas nucleares17,31.

En la Figura 2 se puede apreciar el efecto del tiempo de fijación en formalina sobre el pico G0G1 en células mononucleares a diferentes tiempos (0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 y 30 min). En la Figura 3-A se puede apreciar el efecto inmediato de la formalina tamponada sobre la intensidad de captación de PI, dado por una disminución del canal G0G1. En la Figura 3-B se evidencia el efecto del fijador sobre la variabilidad de captación de PI, lo que se traduce en un aumento del CV G0G1 (comunicación preliminar).

FIGURA 2. Efecto del tiempo de fijación en formalina sobre el piso G0G1 en células mononucleraes. Resultados personales. A partir de sangre venosa K3EDTA como anticoagulante, se separan células mononucleares mediante gradiente de densidad (Hispopaqueâ 1077, Sigma), suspendiéndolas en PBS a una concentración de 1,8 x 106 células/ml. Se incubam 100µl de la suspensión celular con 1 ml de formalina tamponada a diferentes tiempos (0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, y 30 min.), posterior a lo cual se centrifuga a 500 g por 1 min, resuspendiendo en PBS. A continuación, se adiciona tripsina y RNAsa, para finalmente teñir núcleos con yoduro de propidio (PI) (Cycle Test DNA Reagent Kit, BD). La adquisición se realiza en Citómetro de Flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, BD) con software CELL Quest V 3.1 f, previa calibración con eritrocitos de pollo y timocitos de carnero (DNA QC, BD). Se adquiere un mínimo de 20.000 eventos. El análisis de los datos de efectúa en Software Modfit LT 2.0. Se modela fase S en forma trapezoidal con 3 compartimientos, además de modelar debris (distribución multi-cut) y agregados. En gráfico A se puede apreciar el efecto inmediato de la formalina tamponada sobre la intensidad de captación de PI, dado por una disminución del canal G0G1. En gráfico B se evidencia el efecto del fijador sobre la variabilidad de captación de PI, lo que se traduce en un aumento del CV G0G1 (comunicación preliminar).


FIGURA 3. Disociación celular en mucosa del colon normal. Resultados personales. Una muestra de mucosa colónica normal, obtenida en procedimiento endoscópico, es dividida en dos fragmentos, uno de los cuales fue disociado mecánicamente (A) mediante cortes con bisturí junto con agitación vórtex, y el otro (B) se sometió a disociación enzimática con pepsina 0,5% pH 1,5 a 37ºC por 30 min, con agitación vórtex cada 5 min. Una vez que ambos trozos fueron disgregados, se adiciona tripsina y ARNsa, para finalmente teñir núcleos con yoduro de propidio (Cycle Test DNA Reagent Kit, BD). La adquisición se realiza en Citómetro de Flujo FACS Calibur (Becton, Dickinson, BD) con software CELL Quest 3.1 f, previa calibración con eritrocitos de pollo y timocitos de carnero (DNA QC, BD) y optimización del área de la fluorescencia con monucleares de sangre periférica. Se adquiere un mínimo de 20.000 eventos. El análisis se efectúa en Software Modfit LT 2.0, modelando fase S en forma trapezoidal con 3 compartimientos, debris y agregados. En el histograma B se aprecia un aumento de más de tres veces en el CV de G0G1 (gris oscuro) del tejido disociado enzimáticamente, este aumento es el responsable de la disminución de la fase S y de un incremento relativo de la intensidad de fluorescencia (dado por aumento en canal G0G1) con respecto a histograma A disociado mecánicamente. La proporción de Debris (gris claro) y agregados (trama de puntos) se mantiene constante en ambos histogramas.

El grado de impacto del proceso de fijación sobre un histograma de ADN dependerá del tipo de fijador utilizado y del tamaño y densidad del tejido en estudio. Se describen resultados aceptables con formalina neutra tamponada, aun por más de 24 h, sin aumento exagerado de los coeficientes de variación17.

Otra fuente de variación o discrepancia con respecto a un tejido fresco lo constituye la presencia de debris aumentado, lo que puede reducir la capacidad de detectar poblaciones de células tumorales, con un contenido de ADN cercano al diploide17. Las fuentes de debris pueden ser la presencia de tejido necrótico, digestión enzimática (Figura 3), condiciones de fijación del tejido (Figura 2) y el proceso de cortar el bloque de parafina3,4,17,24. El usar secciones de un grosor igual o levemente mayor que 50 µm reduce significativamente la cantidad de debris17,32.

Protocolos de disgregación celular. La elección de un protocolo particular de disociación dependerá de la conservación del fenotipo celular que se requiera en cada estudio en particular. La disociación enzimática en conjunto con agitación mecánica, es el método de elección para estudios de cinética celular y clonogenicidad. El impacto de un determinado protocolo de disociación sobre los componentes de un histograma de ADN variará con el tipo de tumor y con las condiciones de la digestión enzimática17. En la Figura 3 se ejemplifica el efecto de las condiciones de disociación mecánica y enzimática de un tejido fresco de mucosa colónica normal sobre los componentes del histograma de ADN. En el histograma B se aprecia un aumento de más de tres veces en el CV de G0G1 (color rojo) del tejido disociado enzimáticamente, este aumento es el responsable de la disminución de la fase S y de un incremento relativo de la intensidad de fluorescencia (dado por aumento en canal G0G1) con respecto al histograma A disociado mecánicamente (resultados personales).

Definición de controles (repetido). Un desafío del análisis de contenido de ADN y ciclo celular por citometría de flujo de tumores sólidos, lo constituye la definición de control normal. En condiciones ideales se debe usar como control un tejido histológicamente normal, sometido a idénticas condiciones que el tejido a analizar. Al respecto, es necesario considerar (tanto para tejido fresco, como para tejidos en parafina), lo inusual de un tejido con células aneuploides que no presente al menos un pequeño componente de células diploides (células, estromales, endoteliales, etc), lo que permite establecer el pico diploide (G0G1), es decir establecer un control interno. En el caso de poblaciones celulares histológicamente homogéneas se debe considerar la posibilidad de ocupar un control externo o estándar4,11.

En la búsqueda de un tejido de control ideal, es mucho lo que se ha planteado4,11 y un desafío del uso de tejidos incluidos en parafina, lo constituye la definición de control normal. Al usar como control un tejido histológicamente normal y en estado de fijación distinto del tejido tumoral, el punto diploide de referencia definido por el canal del pico G0G1 variará debido a la acción del fijador (Figura 3). Lo anterior trae como consecuencia una alteración en el valor de índice de ADN para un determinado tejido10,11,17,18. Se acentúa la necesidad de poder identificar un control interno en cada muestra cuando esto es posible (un pequeño componente de células diploides).

Si se trabaja con poblaciones homogéneas, la necesidad de un control externo es perentoria. Al respecto se ha sugerido el uso de eritrocitos de pollo, eritrocitos de trucha (eritrocitos nucleados) y linfocitos humanos. En este último caso, su uso se debe hacer con gran precaución, ya que plantea la duda de usar células sanguíneas en la evaluación de células de otro tipo (por ejemplo células epiteliales)4,11. Al respecto, creemos en la necesidad de poder controlar células epiteliales usando células epiteliales normales, y siendo aún más rigurosos, controlar células de estómago usando células de estómago normal, del mismo paciente pero a una distancia mayor a 1,5 cm de la lesión33. El mismo criterio es aplicable a otros tejidos.

El consenso internacional sobre citometría de ADN2,3 sugiere que cada laboratorio debe definir sus propios rangos de referencia para los valores de fases del ciclo celular (alto, intermedio y bajo, tanto para ADN diploide como para tumores con ADN aneuploide), basados en sus propios análisis de diferentes tipos de tejidos (o tumores)3. Al respecto, creemos en la necesidad de evaluar para cada tipo de tejido y/o tumor (diploide o aneuploide), la capacidad pronóstica de la fracción proliferativa (fase S + G2M) para cada población celular, ya que ésta sería más representativa de células en división que la simple determinación de fase S o el promedio de fase S de las poblaciones celulares presentes21-23,34 (conceptos planteados por Castillo JL, en discusión en Internet sobre referencia14 en página web de la Universidad de Purdue: //wwwcytopurdue.edu/hmarchiv/current/suject.html:S-Phase% analysis prognosis for breast cancer, Jan 1999).

Tipos de fluorocromo y citómetros de flujo utilizados. Al existir la posibilidad de utilizar diversos fluorocromos para el estudio de ácidos nucleicos mediante citometría de flujo, es necesario conocer las propiedades y condiciones óptimas de tinción de cada fluorocromo, así como también seleccionarlos en función del citómetro de flujo disponible y del tipo de láser con que éste cuente. Existen diversos fluorocromos utilizables (DAPI, bromuro de etidio, acridine orange, Hoechst 33342, pyronin Y, etc.), pero sin duda uno de los más usados en yoduro de propidio, siendo crítica la concentración usada, resultados con alta variabilidad se obtendrán con bajas concentraciones, mientras en condiciones saturantes, la variabilidad se disminuye considerablemente35.

Análisis de histogramas de ADN. En lo referente al análisis de histogramas de ADN, existen variaciones debido al uso de distintos programas computacionales y distintos modelos matemáticos para estimar las fases del ciclo celular. A consecuencia de esto, el valor estimado de fase S, considerado de valor pronóstico, varía considerablemente6,14,15.

Al momento de analizar un histograma de ADN, el primer paso, y el más difícil, es definir el modelo matemático adecuado para cada serie de datos. Estos modelos matemáticos son complejos y hay decisiones que deben tomarse por parte de quien realiza el análisis.

En el caso del modelo rectangular, el más conservativo para fase S24 y el modelo de elección para tumores sólidos, permite dividir el componente fase S en más de un compartimiento24,25. Al aumentar el número de compartimientos se produce un aumento de los valores de porcentaje de fase S14,15,25,26. Se recomienda el uso de tres compartimientos, ya que la fase S es convenientemente dividida en compartimientos inicial, central y terminal24.

Por su parte, el modelo trapezoidal, que tiene un grado de libertad adicional respecto del modelo rectangular, entrega valores de fase S mayores14,25. El modelo trapezoidal simple (un compartimiento) trabaja bien para tumores sólidos y es el método de estimación de fase S más popular, no obstante, la discusión sobre el número óptimo de compartimientos del modelo rectangular, también es aplicable al modelo de estimación de fase S trapezoidal.

A su vez el modelo polinomial tiene un grado de libertad adicional, sobre el modelo trapezoidal y lógicamente dos grados de libertad sobre el modelo rectangular, siendo necesario usarlo con mucha cautela25. La flexibilidad aumentada de este modelo puede representar un problema para el análisis de ADN de tumores sólidos24. Si el CV de G0G1 está levemente elevado o si hay una cantidad considerable de debris, este modelo puede entregar resultados falsos o aberrantes, por lo que no es recomendado para el análisis de ADN rutinario de tumores sólidos24.

La presencia de "debris" en conjunto con el tipo de tejido utilizado (fresco o fijado) son un factor preponderante al momento de analizar un histograma de ADN. En el mejor de los casos, la señal correspondiente al debris es pequeña e insignificante en la región del histograma ocupada por el ciclo celular4. Desafortunadamente, no siempre es así, siendo muy importante modelar la curva de "debris", con el fin de minimizar su efecto sobre la estimación del ciclo celular4. El "debris" puede afectar los cálculos de fase S3, y las diferencias en la precisión de los estimados de fase S pueden comprometer la predicción del curso clínico del paciente, su sobrevida o respuesta a tratamiento3 (Figura 4). Algunos estudios han comunicado que el "debris" interfiere con la medición del porcentaje de células en fase S, y que cuando se aplica una corrección al "debris", la estimación de fase S es más comparable con los índices de marcación con 3H-timidina12 y es pronósticamente mejor6,13.

FIGURA 4. Análisis de histograma de ADN usando diferentes modelos de estimación. Resultados personales. Una muestra de mucosa gástrica de un paciente con linfoma gástrico, obtenida en procedimiento endoscópico, fué disociada enzimáticamente con pepsina 0,5% pH 1,5 a 37ºC por 30 min, con agitación vórtex cada 5 min. Una vez disgregadas, se adiciona tripsina y RNAsa, para finalmente teñir núcleos con yoduro de propidio (Cycle Test DNA Reagent Kit, BD). La adquisición se realiza en Citómetro de Flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, BD) con software CELL Quest V 3.1 f, previa calibración con eritrocitos de pollo y timocitos de carnero (DNA QC, BD) y optimización del área de la fluorescencia con monucleares de sangre periférica. Se adquiere un mínimo de 20.000 eventos. El análisis de los mismos datos se efectúa en Software Modfit LT 2.0. Se modela fase S en forma rectangular (histograma A), trapezoidal (histograma B) y polinomial (histograma C), usando en todos 3 compartimientos, además de modelar debris (distribución multi-cut) y agregados. Se puede apreciar el efecto sobre los componentes del ciclo celular, principalmente G0G1 (gris oscuro) y fase S (achurado), en especial en el histograma B comparado con histogramas A y B. En histograma D se puede ver análisis modelando fase S en forma rectangular y con tres compartimientos, evidenciándose el efecto de no modelar debris (gris claro) y agregados (trama de puntos) sobre los parámetros del ciclo celular, principalmente sobre fase S y CV de G0G1.

Al considerar la presencia de agregados, es necesario considerar que no sólo las células G0G1 se agregan, las células en fase S, en G2M y también fragmentos nucleares (debris) se agregarán entre ellos o con las células G0G1. Dado que la fracción de agregados está siempre presente, aunque no sea visualmente aparente, se transforma en un factor de suma importancia al momento de comparar valores de porcentajes de fase S de diferentes estudios que utilizan y no utilizan la corrección de agregados4,6.

En la Figura 4 es posible apreciar el efecto del uso de distintos modelos matemáticos para la estimación de las fases del ciclo celular. En mucosa gástrica de un paciente con linfoma gástrico, obtenida en procedimiento endoscópico, fue disociada enzimáticamente con pepsina 0,5% pH 1,5 a 37°C por 30 min y marcada con yoduro de propidio. Se modela fase S en forma rectangular (histograma A), trapezoidal (histograma B) y polinomial (histograma C), usando en todos 3 compartimientos, además de modelar debris (distribución multi-cut) y agregados. Se puede apreciar el efecto sobre los componentes del ciclo celular, principalmente G0G1 (color rojo) y fase S (achurado), en especial en el histograma B comparado con histogramas A y B. En histograma D se puede ver análisis modelando fase S en forma rectangular y con tres compartimientos, evidenciándose el efecto de no modelar debris (color azul) y agregados (color verde claro) sobre los parámetros del ciclo celular, principalmente sobre fase S y CV de G0G1 (resultados personales).

La confiabilidad de los resultados estimados del ciclo celular pueden y deben ser evaluados bajo criterios de control de calidad internos, como por ejemplo CV menor a un 8%, debris más agregados menos al 20%, así como coeficientes matemáticos que indican el nivel de acertividad del modelo elegido para describir los datos del histograma (RCS: Reduced chi-square)11,19,24.

CONCLUSIONES

Son varios los aspectos a destacar al momento de comentar en forma integrada el estudio de contenido de ADN por citometría de flujo, tanto en caso de utilizar tejido fresco, fresco-criopreservado o fijado e incluido en parafina:

1) Representatividad y calidad de la muestra de tejido a estudiar.
2) Elección del protocolo de disociación celular que más se acomode al fenotipo a estudiar.
3) Correcta definición de controles internos y externos, idealmente del mismo tipo de tejido que se está analizando, pero con características normales y sometido a las mismas condiciones (almacenamiento, fijación, etc) que la muestra en estudio.
4) Elección adecuada del modelo de análisis que más se acomode a la serie en estudio, usando dicho modelo para comparar muestras del mismo tipo de tejido que la serie original.
5) Evaluación correcta de los resultados estimados del ciclo celular de acuerdo a controles de calidad internos (CV, debris, agregados, RCS).
6) Evaluación para cada tipo de tejido y/o tumor (diploide o aneuploide) de la capacidad pronóstica de la fracción proliferativa (fase S + G2M) para cada población celular.

Estos aspectos, nuestro grupo los ha discutido públicamente en Internet
( //www.cytopurdue.edu/hmarchiv/curren/subject.html; S% analysisprognosis for breast cancer, Jan 1999), junto con recalcar que el objetivo del estudio de ADN en tejidos, es proporcionar al clínico una información adicional desde el punto de vista pronóstico y también diagnóstico, se hace necesario que las distintas publicaciones del tema no sólo tengan una concordancia entre sí, si no que además una rigurosidad metodológica y analítica, con el objeto de obtener conclusiones que sean comparables2.

Correspondencia a: Juan L. Castillo N. Laboratorio de Citometría de Flujo, Hospital del Trabajador, Concepción. Cardenio Avello 36, Concepción. Fono 56-41-2017722. Fax: 56-41-201708. E-mail: axelyoyi@entelchile.net

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