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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.127 n.11 Santiago nov. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98871999001100003 

Efecto inmunosupresor in vitro de
las lipoproteínas de baja densidad

In vitro inhibition of lymphocyte
proliferation by low density
lipoproteins

Margarita González R1, Ivette Sanz C2, Nina Rojas S,
Víctor Silva F3, Lilian Kirsten L4, Marcelo Bustamante C5.

Background: Immune cells participate in the formation of atheromatous plate, however little is known about the effects of native or oxidatively modified lipoproteins on these cells. Aim: To study the effects of lipoproteins on in vitro mononuclear cell proliferation. Material and methods: Peripheral blood mononuclear cells were obtained from 10 patients with type 2 diabetes mellitus (aged 52 ± 9 years old with a disease duration of 8.2 ± 5.7 years and a mean glycosilated hemoglobin of 9.3 ± 2.2%) and 10 non diabetic healthy controls (aged 50.3 ± 7.1 years old). These were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) alone or in the presence of native LDLS, malondialdehyde modified LDLs or glycated LDLs. Proliferation was measured as 3H-thymidine incorporation and expressed as Stimulation Index (SI). Results: SI of patients and healthy subjects, after PHA stimulation were similar: (57.5 ± 29.8 and 61.1 ± 23.5) respectively LDLs did not induce proliferation in neither group. Native LDLs produced a 98% inhibition of PHA induced proliferation. Malondialdehyde modified and glycated LDLs caused a 50% inhibition. The suppressive effect was maintained when lipoproteins were incorporated to culture media 60 min prior or after PHA stimulation. Conclusions: Lipoproteins inhibit in vitro PHA induced peripheral blood mononuclear cell proliferation both in diabetic and in non diabetic subjects.
(Key-words: Atherosclerosis; Lipoproteins; Lipoproteins, LDL; Lymphocyte transformation).

Recibido el 29 de marzo, 1999. Aceptado el 27 de septiembre, 1999.
Trabajo financiado por proyecto 96.072.014-1. Dirección de Investigación. Universidad
de Concepción. Chile.
Departamentos de: Bioquímica Clínica e Inmunología, Facultad de Farmacia. Estadística,
Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Biológicas. Universidad de Concepción. Policlínico de Endocrinología. Hospital Regional.
Concepción. Chile.
1 Bioquímico, M.Sc. Inmunología
2 Bioquímico, Tesista de Magister en Bioquímica Clínica
3 Bioquímico, M.Sc. Bioquímica
4 Magister en Estadística
5 Bioquímico, Ph.D

La aterosclerosis constituye la mayor causa de morbi-mortalidad en pacientes diabéticos. El mecanismo de esta asociación diabetes-aterosclerosis aún no está dilucidado. Sin embargo, es conocido que la dislipidemia constituye un factor de riesgo, atribuyéndose un rol fundamental a las lipoproteínas de baja densidad (LDLs) modificadas en este proceso.

Se ha demostrado que LDLs modificadas son captadas por macrófagos a través de receptores específicos transformándolos en células espuma, las que constituyen el punto de partida de la placa ateromatosa1.

Las LDLs están formadas por apolipoproteínas (mayoritariamente Apo B100), colesterol esterificado, colesterol libre, triglicéridos y fosfolípidos. La oxidación de las LDLs puede ser realizada por las células presentes en la placa ateromatosa o promovida por radicales libres producidos por ellas. Las modificaciones oxidativas de los lípidos generan aldehídos altamente reactivos (ej. 4-hidroxinonenal y malondialdehído) y otros productos que pueden modificar la Apo B 100 en los residuos de lisina2.

Dado que la oxidación de las lipoproteínas es un proceso complejo, dará origen a diversos neoantígenos que alcanzan alta concentración en la placa ateromatosa, en la cual también existen clones de linfocitos T y B de distinta especificidad3. Los linfocitos T son un componente celular importante en la aterosclerosis ya que están presentes en la lesión temprana, constituyen alrededor del 20% de las células de la capa fibrosa en la lesión avanzada e interactúan con los macrófagos ricos en colesterol (células espuma).

La hiperglicemia en los pacientes diabéticos promueve procesos de glicación y/o glicoxidación debido a que la glucosa reacciona con proteínas para formar productos tempranos de glicación (productos de Amadori) que pueden evolucionar a productos de glicación avanzada (AGEs); éstos pueden ser captados por su receptor específico en los macrófagos, los que se transforman en células espuma, contribuyendo también a la formación del ateroma4. A su vez, la LDL glicada es autoantigénica e induciría la formación de autoanticuerpos.

La presencia de autoanticuerpos séricos contra estas formas modificadas de lipoproteínas ha sido demostrada tanto en pacientes diabéticos tipo 1 como tipo 25,6 y los anticuerpos circulantes anti LDL oxidada están involucrados en el proceso aterosclerótico7. Los macrófagos, a través del receptor Fcy captan los complejos inmunes formados, se transforman en células espuma y promueven inflamación crónica a través de la liberación de citoquinas8. Este proceso inflamatorio auto-sustentado permite postular la alteración de mecanismos supresores que participen en el proceso aterosclerótico acelerado del diabético.

Dada la participación de las células inmunes en la placa ateromatosa y el rol de los linfocitos T en la generación de respuesta inmune contra autoantígenos en pacientes con diabetes mellitus tipo 2, el propósito de este trabajo es investigar la acción de las LDLs nativas y modificadas en la proliferación de linfocitos T inducida, in vitro, por fitohemaglutinina.

PACIENTES Y MÉTODOS

Pacientes: Se estudiaron 10 pacientes con diabetes mellitus tipo 2 con edad 52 ± 9,4 años (rango 41 a 67 años), duración de la diabetes 8,2 ± 5,7 años, del Servicio de Endocrinología del Hospital Guillermo Grant de Concepción. Los sujetos control fueron 10 voluntarios no diabéticos y no fumadores con edad 50,3 ± 7,1 años (rango 41 a 66 años).

A todos los sujetos en estudio se les determinó glicemia, colesterol total, colesterol-HDL, colesterol-LDL, triglicéridos y hemoglobina glicada. Todos estaban en conocimiento informado y este trabajo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Concepción. Las características clínicas y los parámetros bioquímicos de los sujetos en estudio se muestran en la Tabla 1.

Modificación de las LDLs: Las LDLs fueron obtenidas desde plasma/EDTA de voluntarios sanos, no diabéticos, normolipémicos y no fumadores, mediante ultra centrifugación (1.019-1.050 g/ml). Las LDLs fueron modificadas por oxidación con malondialdehído (el principal producto de oxidación in vivo de la LDL) de acuerdo al método descrito por Haberland9 o por glicación no enzimática según el método de Pecorado10. Las modificaciones fueron confirmadas por electroforesis en agarosa, emisión de fluorescencia y sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico.

Ensayo de proliferación de células mononucleares: En ambos grupos, se obtuvo células mononucleares (CMN) de acuerdo al método de Böyum11 a partir de sangre venosa/EDTA (1 mg/ml). Las CMN fueron lavadas y ajustadas a 5x105 cells/ml en RPMI 1640 suplementado con antibióticos, 1% de suero autólogo y ß-mercaptoetanol 5x10-5M. Los cultivos celulares fueron incubados con: 1) Fitohemaglutinina 0,8 µg/pocillo o LDL nativa 50 µg/pocillo, o LDL malondialdehizada 50 µg/pocillo, o LDL glicada 2 µg/pocillo (concentraciones mayores de LDL glicada disminuyeron la viabilidad celular); 2) Fitohemaglutinina más las LDLs agregadas a los cultivos ya sea juntas, 1 h antes o después del mitógeno. Los cultivos celulares fueron incubados por 72 h a 37°C, 5% CO2 y 95% humedad; 16 h antes de cosechar las células se les agregó timidina tritiada (0,5 µCi/pocillo, actividad específica 47 Ci/mmol). Cada ensayo fue realizado en triplicado y los resultados son expresados como índice de estimulación (IE), calculado por el cuociente entre las cuentas por min del cultivo con estímulo/cuentas por min del cultivo sin estimular. Se consideró proliferación positiva un IE mayor o igual a 3. La viabilidad celular durante los ensayos se mantuvo > 90%.

Análisis estadístico: La comparación entre los grupos fue realizada mediante la prueba t de Student con muestras independientes.

RESULTADOS

Las características clínicas y los parámetros bioquímicos de los grupos en estudio (Tabla 1) muestran que al comparar los pacientes diabéticos con los sujetos control, existe diferencia significativa en la glicemia y hemoglobina glicosilada (p< 0,01) y en la concentración de colesterol total (p< 0,05). En la concentración de LDL- colesterol, HDL-colesterol y triglicéridos no se detectó diferencias significativas.

Tabla 1. Características clínicas y parámetros bioquímicos de los pacientes
con diabetes mellitus tipo 2 y los sujetos control

  Diabéticos
Control

n   10       10  
Edad (años) 52 ±   9,4       50,3 ±   7,1
Sexo (M/F)   5/5       5/5  
Duración de la diabetes (años)   8,2 ±   5,7   _ ±  
Glicemia (mg/dl) 212     ± 104,5*   92 ± 10,1
Hb A1c (%)   9,3 ±     2,2*       5,1 ±   0,3
Colesterol total (mg/dl) 207     ±     54,6**   169   ± 23,2
LDL-colesterol (mg/dl) 119     ± 63,2   81 ± 20,9
HDL-colesterol (mg/dl)   51,2 ± 10,4   57 ± 12,8
Triglicéridos (mg/dl) 163     ± 62,1   153   ± 71,9

* p < 0,01 entre los dos grupos
** p <0,05 entre los dos grupos

Los IE obtenidos con fitohemaglutinina (PHA) fueron 57,5 ± 29,8 para los pacientes y 61,1 ± 23,5 para los sujetos control; no presentan diferencias estadísticamente significativas. Así mismo, en todos los sujetos en estudio, la LDL nativa (LDLn), LDL malondialdehizada (LDLmda) y LDL glicada (LDLg) no indujeron proliferación linfocitaria, obteniéndose índices de estimulación < 3, sin presentar diferencias significativas entre pacientes diabéticos y sujetos control (Tabla 2).

Tabla 2. Efecto de PHA, LDL nativa y LDL mda y LDL g en
la proliferación de células mononucleares de sangre periférica

   
Indice de estimulación
 
 
PHA
LDL n
LDL mda
LDL g

Pacientes diabéticos 57,5 ± 29,8 1,1 ± 0,8 1,1 ± 0,8 1,1 ± 3,2
Sujeto control 61,1 ± 23,5 0,6 ± 0,4 0,9 ± 0,5 0,9 ± 0,5

Cada cultivo fué realizado por triplicado y los resultados expresados como índice de estimulación (> a 3 indica estímulo positivo). Se informa promedio ± DE
LDL mda: LDL malondialdehizada LDL g: LDL glicada

Como se muestra en la Tabla 3, las LDLs administradas junto con PHA inhibieron la linfoproliferación inducida por el mitógeno, tanto en los pacientes como en los sujetos control, LDLn produjo 98,3% y 99,2% de inhibición respectivamente, presentando diferencias significativas en relación al IE obtenido con PHA sola para cada grupo (p< 0,001). Con LDLmda, en cambio, la linfoproliferación fue inhibida 54,6% y 53,2, respectivamente, mientras que con LDLg la inhibición fue 58,6% para los pacientes diabéticos y 48,6% para los sujetos control. Ambas respuestas presentaron diferencias significativas (p< 0,01) respecto al IE obtenido con PHA sola; no se obtuvo diferencias significativas entre los pacientes diabéticos y los sujetos control.

Tabla 3. Inhibición de la linfoproliferación inducida por fitohemaglutinina al agregar
LDL nativa y LDL modificada junto con el mitógeno

Estímulo
Pacientes diabéticos
Sujetos control
 
I.E.
Inhibición (%)
I.E.
Inhibición (%)

Fitohemaglutinina 57,5± 29,8   0,0 61,1  ± 23,5   0,0
Fitohemaglutinina + LDLn 1,0±   0,7* 98,3 0,5  ±   0,3* 99,2
Fitohemaglutinina + LDLmda 26,1± 18,1¥ 54,6 28,6s± 19,0¥ 53,2
Fitohemaglutinina + LDL g 23,8± 20,2¥ 58,6 31,4  ± 23,8¥ 48,6

Se informa promedio ± DE
* p<0,001 con respecto al IE obtenido con PHA
¥ p< 0,01 con respecto al IE obtenido con PHA.

Para investigar si las LDLs afectan la expresión del receptor (putativo) para PHA, se pre-incubó las CMN durante 60 min con LDL nativa o modificadas antes de estimular con el mitógeno. Los resultados, expresados como % de inhibición de la respuesta obtenida con PHA (Tabla 4), muestran que tanto en diabéticos como en sujetos control, se mantuvo el efecto supresor de las lipoproteínas: con LDLn 98,3% y 99,2%; con LDLmda 51,0% y 54,1%; y con LDLg 59,2% y 61,5%, respectivamente (p= ns entre los pacientes diabéticos y los sujetos control).

Tabla 4. Efecto de LDL nativa y LDL modificada en la proliferación inducida
por fitohemaglutinina al ser agregadas una h antes o después del mitógeno

 
Pacientes diabéticos
Sujetos control
 
% de Inhibición
% de Inhibición
  antes después antes después

LDL n 98,3* 98,6* 99,2* 99,2*
LDL mda 51,0** 47,7** 54,1** 50,0**
LDLg 59,2** 60,6** 61,5** 37,0**

% de inhibición calculado con los índice de estimulación obtenidos para cada lipoproteína y con respecto al índice de
estimulación obtenido para fitohemaglutinina.
* p <0,001 y ** p < 0,01 en relación con la respuesta obtenida para fitohemaglutinina.

Para verificar si las LDLs nativas y modificadas afectan la estimulación ya inducida por PHA, los cultivos celulares fueron estimulados con el mitógeno y 60 min después se les agregó las LDLs (Tabla 4). Nuevamente se manifestó el efecto supresor: con LDL nativa 98,6% de supresión para los diabéticos y 99,2% de supresión para los sujetos control; con LDLmda, 47,7% de supresión para los diabéticos y 50% para los sujetos control. Con LDL glicada se obtuvo 60,6% de inhibición en la respuesta de los linfocitos obtenidos de pacientes diabéticos siendo estadísticamente significativo (p < 0,05) del 37% de inhibición de la respuesta obtenida para los linfocitos de sujetos control. Del mismo modo, los linfocitos de sujetos control presentan diferencias significativas en inhibición de la respuesta proliferativa al agregar la LDL glicada antes (61,5%) o después (37%) de la PHA con p<0,05.

DISCUSIÓN

El rol fisiológico principal de las lipoproteínas de baja densidad es el transporte de colesterol12. Sin embargo, las LDLs poseen otras funciones como son: inducir señales relacionadas con activación celular, modular la expresión de moléculas de adhesión celular y de factores tisulares13. Las LDLs oxidadas son mitogénicas para células de músculo liso8 y estimulan la migración de monocitos y linfocitos T14, participando en aterogénesis y en la mantención de la placa ateromatosa.

La presencia de receptores para LDL ha sido demostrada en macrófagos, células asesinas naturales (nK), linfocitos T y linfocitos B. En linfocitos T y en células nK la expresión del receptor de (Rc-LDL) puede ser inducida por IL-2, sugiriendo una relación entre citoquinas y metabolismo de lipoproteínas15,16.

El rol preciso de los linfocitos T en la lesión ateromatosa aún no está del todo aclarado. Se ha postulado que estas células serían activadas en presencia de antígenos específicos tales como LDL oxidada, proteínas de estrés térmico (hsp)17, proteínas bacterianas (ej. Chlamydia pneumoniae) y virales18,19. A su vez, los linfocitos T al secretar citoquinas pueden contribuir a la mantención de la placa20-22.

En relación con proliferación in vitro de linfocitos T de sangre periférica, en este trabajo no fue posible detectar linfocitos T-LDL específicos en los pacientes diabéticos, ya que no hubo proliferación linfocitaria con las LDLs nativas o modificadas solas (Tabla 2). Esto podría deberse a que los linfocitos específicos queden recluidos en los ganglios linfáticos regionales o bien que aquellos linfocitos T LDL-específicos que estuvieran en circulación requieran de estímulos exógenos para proliferar (IL-2)15. Otra posibilidad es que los clones específicos para LDL estén en muy baja concentración y no puedan ser detectados por las condiciones de cultivo. Sin embargo, está descrito que LDL oxidada activa linfocitos obtenidos desde la placa ateromatosa necesitando estimulación por parte de los monocitos, demostrando con esto la presencia de linfocitos T-LDL oxidada específicos3.

En relación con el rol regulador de las lipoproteínas sobre la respuesta mitogénica inducida en linfocitos T, este trabajo es el primero en informar acerca del rol antilinfoproliferativo de LDL nativa, LDL oxidada y LDL glicada sobre linfocitos estimulados, in vitro, obtenidos tanto de pacientes con diabetes mellitus tipo 2 como de sujetos control. La literatura de apoyo a este tema es escasa; sólo dos trabajos que datan de la década de los ochenta, describen que tanto lipoproteínas de baja densidad como de alta densidad nativas afectan la respuesta inducida por mitógenos (Fitohemaglutinina y Concanavalina A) sobre linfocitos obtenidos de sangre periférica de sujetos aparentemente sanos23. Los resultados descritos por nosotros en este trabajo concuerdan con estos hallazgos, puesto que LDL nativa, oxidada o glicada disminuyeron el efecto proliferativo inducido por PHA. En 1998, Caspar-Bauguil y col. describieron que LDLs levemente oxidadas por acción de rayos UV detienen el ciclo celular en fase G1/S, no producen apoptosis, suprimen la proliferación de linfocitos T CD4+ activados obtenidos de sujetos aparentemente sanos y disminuyen la síntesis de DNA inhibiendo la expresión del receptor para IL-224.

El hecho que este efecto inmunosupresor de las LDLs se manifieste por igual en pacientes diabéticos y en sujetos control no diabéticos, indica que en el proceso aterosclerótico acelerado del diabético no estaría involucrado este mecanismo supresor de la respuesta proliferativa de linfocitos T.

Respecto a la acción del mitógeno PHA, no está descrita la estructura de su receptor. Sin embargo, se postula que este mitógeno se une a oligosacáridos de membrana en linfocitos T, cuyas moléculas blanco de interacción los marcadores CD2, CD3 y moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC clase 1), siendo éste importante en la proliferación inducida por PHA25.

Así mismo, llama la atención que este rol inmunosupresor de las LDLs se manifieste por igual en pacientes con mal control metabólico y colesterol alto y en sujetos control no diabéticos. Debido a que experimentos recientes demuestran que la aterosclerosis es una patología inmunológicamente mediada26,27, es necesario profundizar los conocimientos acerca de la regulación del proceso aterosclerótico acelerado del diabético, como también estudiar en forma profunda este rol inmunosupresor o inmuno regulador de las lipoproteínas tanto en forma fisiológica como asociado a patologías.

Correspondencia a: Margarita González R. Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología. Facultad de Farmacia. Universidad de Concepción. Casilla 237. Concepción. Chile. FAX 56-41 231903. e-mail: magonzal@mail.udec.cl

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