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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.127 n.8 Santiago ago. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98871999000800005 

Vigilancia de susceptibilidad de
cocáceas grampositivas a
betalactámicos, glicopéptidos y otros
antimicrobianos

Surveillance of Gram positive cocci
susceptibility to betalactamics,
glycopeptides and other
antimicrobials

María Soledad Giglio M1, Orietta Farías M1, Mónica
Lafourcade R, María Eugenia Pinto C.

Background: During the last decade, there has been a progressive increase in the resistance of gram (+) cocci to betalactamics and other antimicrobials. Therefore, vancomycin and teicoplanin have incorporated as alternative antimicrobial drugs. Aim: To assess the susceptibility of gram (+) cocci to different antimicrobials including vancomycin and teicoplanin. Material and methods: We studied 447 strains of gram (+) cocci coming from ambulatory and hospitalized patients. These included 308 Enterococcus sp strains, 99 Staphycoccus aureus strains and 40 coagulase negative Staphylococci strains. Enterococci susceptibility was measured using minimal inhibitory concentrations in agar and that of Staphylococci, through diffusion. Susceptibility to vancomycin and teicoplanin was measured using minimal inhibitory concentrations in all strains. Results: Enterococcus faecalis was 100% susceptible to ampicillin, penicillin, vancomycin and teicoplanin, 23% susceptible to tetracyclin and 47% to chloramphenicol. Susceptibility of E faecium was 61% to penicillin, 49% to chloramphenicol, 41% to tetracyclin, 100% to vancomycin and teicoplanin. Of 19 Enterococcus spp strains, 90% were susceptible to ampicillin, 80% to penicillin, 55% to chloramphenicol and 45% to tetracyclin. Only one E casseiflavus strain had a low level resistance to vancomycin and was susceptible to teicoplanin. No Staphylococcus aureus strain was resistant to vancomycin or teicoplanin. Conclusions: A permanent surveillance of gram (+) cocci antimicrobial susceptibility is required to update therapeutic schemes.
(Key Words: Drug resistance, microbial; Gram-positive bacterial infectious; Gram-positive cocci)

Recibido el 4 de noviembre, 1998. Aceptado en versión corregida el 20 de mayo, 1999.
Unidad de Microbiología Occidente, Programa de Microbiología y Micología, Instituto de
Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile y Laboratorio
de Microbiología, Hospital San Juan de Dios.
1 Tecnólogo Médico

La última década se ha caracterizado por el incremento progresivo de la resistencia a los ß-lactámicos y otros antimicrobianos en cocáceas grampositivas como Staphylococcus, Enterococcus y Streptococcus. En relación a glicopéptidos, en los Estados Unidos se ha informado una resistencia de Enterococcus a vancomicina de 13,6% en el año 1993, en pacientes hospitalizados en Unidades de Cuidado Intensivo1,2. En Latinoamérica se ha descrito una cepa de Enterococcus faecalis y una de E faecium aisladas en hemocultivo en Argentina3,4 y cepas de susceptibilidad intermedia en Brasil5. En Europa también se han encontrado últimamente cepas resistentes en muestras clínicas, provenientes de procesos infecciosos6-8, y en algunos países sólo se han detectado en muestras de deposición en estudios de vigilancia9,10. La resistencia de Enterococcus spp a glicopéptidos se debe a la modificación del sitio blanco, lo que está codificado en el DNA en diferentes genes denominados vanA, vanB, vanC-1 y vanC2/32,11. Por otro lado, en Japón y USA se han descrito cepas de S coagulasa negativa resistentes y S aureus con reducida susceptibilidad a vancomicina y teicoplanina12-15. Actualmente, los glicopéptidos son considerados en los esquemas terapéuticos en pacientes con infecciones graves, por cocáceas grampositivas resistentes a los antimicrobianos de uso habitual, como cloxacilina para Staphylococcus y ampicilina para Enterococcus. Dada la aparición de cepas con susceptibilidad reducida o bien resistentes en otras partes del mundo, se decide evaluar en el área Occidente de la Región Metropolitana la susceptibilidad de cepas de Enterococcus spp, Staphylococcus coagulasa negativa y Staphylococcus aureus a diferentes antimicrobianos, determinar la existencia eventual de resistencia a vancomicina y teicoplanina y detectar el probable mecanismo de resistencia, si éste existiera.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas. Se estudiaron 447 cepas de cocáceas grampositivas aisladas entre enero 1996 y agosto 1997 de muestras clínicas de pacientes ambulatorios y hospitalizados con diferentes patologías, provenientes del Hospital San Juan de Dios. Se incluyó sólo una cepa de la misma especie por paciente.

Las cepas identificadas correspondieron a 308 de Enterococcus spp (249 E faecalis, 39 E faecium, y 5 E casseliflavus, 2 E solitarius, 4 E hirae, 2 E rafinossus, 3 E durans, 3 E faecalis variant y 1 E avium), 74 cepas de Staphylococcus aureus meticilino resistente, 25 S aureus meticilino sensible y 40 cepas de Staphylococcus coagulasa negativa16.

Concentración inhibitoria mínima (CIM). Se determinó por dilución en agar de acuerdo a normas de la NCCLS17,18. Para Enterococci, los antimicrobianos utilizados fueron: vancomicina (Laboratorio Beta), teicoplanina (Laboratorio Hoechst Marion Roussel), penicilina, ampicilina, cloranfenicol y tetraciclina (Laboratorio Chile). La susceptibilidad de Staphylococcus se estudió por método de difusión en agar con sensidiscos (SDA) para oxacilina (1 µg), cefazolina (30 µg), rifampicina (5 µg), tetraciclina (30 µg), cotrimoxazol (1,25/23,74 µg), cloranfenicol (30 µg), lincomicina (2 µg), eritromicina (5 µg), ciprofloxacino (5 µg) y por dilución en agar para vancomicina (Laboratorio Beta) y teicoplanina (Hoechst Marion Roussel). Los halos de inhibición y puntos de corte se compararon con las tablas NCCLS M-5 1995. Se utilizaron las cepas S aureus ATCC 29213 y E faecalis ATCC 29212 para control de ambos métodos. La detección de beta lactamasa se realizó mediante método de la nitrocefinasa (Difco).

Presencia de genes de resistencia vanA, vanB, vanC-1 y vanC2/3. Se detectó mediante reacción de polimerasa en cadena (PCR) usando partidores de oligonucleótidos sintetizados en el Programa de Biología Celular y Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, los cuales tuvieron como controles positivos y negativos cepas enviadas por el Dr. Lance Peterson (Chicago) y Dr. C Mac Donald (Atlanta) de los Estados Unidos. Se utilizó la siguiente metodología: se toman 3 a 4 colonias de una placa de agar sangre de cultivo de 18 h a 37ºC y se suspenden en 200 µl de buffer TE 1 X. Las bacterias son lisadas a 95ºC por 10 min y colocadas en hielo. Se preparan 36 µl de mezcla para PCR que contiene 10 pml de cada partidor, 1,25 U de la enzima Taq polimerasa (Gibco), 200 µM de cada nucleótido, 1,5 mM de MgCl2 y 4 µl de buffer 10 X. A esta mezcla se agrega 4 µl de la bacteria lisada y se colocan gotas de aceite mineral. La amplificación se realiza en termociclador (MJ Research) en 36 ciclos (94ºC por 1 min, 56ºC por 1 min, y 74ºC por 1 min). Se toman 20 µl del producto de PCR y se realiza electroforesis en gel de agarosa (Sigma ultra pure) al 1%. Al finalizar, se tiñe con bromuro de etidio (0,1%) para su lectura19.

RESULTADOS

En la Tabla 1 se observa la susceptibilidad de 74 cepas de S aureus meticilino resistente (SAMR) a diferentes antimicrobianos, destacándose el bajo porcentaje de susceptibilidad a rifampicina (56,7%), tetraciclina (50%), cotrimoxazol (44,5%). La CIM 90 fue de 1 µg/ml para vancomicina y 0,5 µg/ml para teicoplanina con 100% de susceptibilidad.

Tabla 1. Susceptibilidad de 74 cepas de Staphylococcus aureus meticilino resistente a 8
antimicrobianos, por difusión en agar y concentración inhibitoria mínima (CIM) a glicopéptidos

Antimicrobiano n % CIM 50 µg/ml* CIM 90 µg/ml**

Vancomicina 74 100 1   1
Teicoplanina 74 100       0,25      0,5
Rifampicina 42      56,7    
Tetraciclina 37    50    
Cotrimoxazol 33      44,5    
Cloranfenicol   6       8,1    
Lincomicina   2       2,7    
Eritromicina 74     0    

* Punto de corte según NCCLS para vancomicina: sensible: £4 µg/ml, intermedia 8-16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.
** Punto de corte según NCCLS para teicoplanina: sensible: £8 µg/ml, intermedia 16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.

Para S aureus meticilino sensible se observa una elevada susceptibilidad a prácticamente todos los antimicrobianos estudiados, pero llama la atención un 12% de resistencia a eritromicina. La CIM para ambos glicopéptidos es similar a la observada para SAMR (Tabla 2).

Tabla 2. Susceptibilidad de 25 cepas de Staphylococcus aureus meticilino sensible a 10
antimicrobianos, por difusión en agar y concentración inhibitoria mínima (CIM) a glicopéptidos

Antimicrobiano n % CIM 50 µg/ml* CIM 90 µg/ml**

Vancomicina 25 100 1   1
Teicoplanina 25 100       0,25      0,5
Rifampicina 25 100    
Tetraciclina 25 100    
Cefazolina 25 100    
Cotrimoxazol 24   96    
Ciprofloxacino 24   96    
Lincomicina 24   96    
Eritromicina 22   88    
Cloranfenicol 19   76    

* Punto de corte según NCCLS para vancomicina: sensible: £4 µg/ml, intermedia 8-16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.
** Punto de corte según NCCLS para teicoplanina: sensible: £8 µg/ml, intermedia 16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.

 

El 50% de las cepas de S coagulasa negativa fueron susceptibles a meticilina y 42,5% y 37,5% a lincomicina y eritromicina, respectivamente. A diferencia de los resultados obtenidos para S aureus, la CIM para teicoplanina es más elevada que para vancomicina (Tabla 3).

Tabla 3. Susceptibilidad in vitro de 40 cepas de Staphylococcus coagulasa negativa a 11
antimicrobianos, por difusión en agar y concentración inhibitoria mínima (CIM) a glicopéptidos

Antimicrobiano n % CIM 50 µg/ml* CIM 90 µg/ml**

Vancomicina 40 100 1 2
Teicoplanina 40 100 2 4
Rifampicina 35      87,5    
Tetraciclina 33      82,5    
Cefazolina 32     80    
Ciprofloxacino 28     70    
Oxalicina 20     50    
Eritromicina 18     45    
Cotrimoxazol 16     40    
Lincomicina 17       42,5    
Cloranfenicol 15       37,5    

* Punto de corte según NCCLS para vancomicina: sensible: £4 µg/ml, intermedia 8-16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.
** Punto de corte según NCCLS para teicoplanina: sensible: £8 µg/ml, intermedia 16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.

En la Tabla 4 se observa que E faecalis fue 100% sensible a penicilina y ampicilina; por el contrario, la susceptibilidad a tetraciclina y cloranfenicol fue de 23,2% y 46,9%, respectivamente. La CIM 90 para vancomicina fue de 2 µg/ml y para teicoplanina 0,25 µg/ml, con 100% de susceptibilidad. En Enterococcus faecium se observó que 61,5% fue sensible a penicilina y 69,2% a ampicilina. Las otras especies de Enterococcus tienen una susceptibilidad similar a Enterococcus faecium, existiendo una cepa de E casseliflavus con sensibilidad intermedia a vancomicina (8 µg/ml) y sensible a teicoplanina. En esta cepa se detectó por PCR el gen de resistencia vanC1 y vanC2/3.

Tabla 4. Susceptibilidad de 308 cepas de Enterococcus spp, por método dilución en agar a 6
antimicrobianos

  E faecalis E faecium Enterococcus spp
  n = 249 n = 39 n = 20
  CIM 50 CIM 90 % CIM 50 CIM 90 % CIM 50 CIM 90 %
Antimicrobiano µg/ml µg/ml   µg/ml µg/ml   µg/ml µg/ml %

Penicilina 2    2 100 2 128       61,5 2 16      80
Ampicilina 0,5 1 100 1 32         69,2    0,5 8   90
Vancomicina  1    2 100 1   2  100 1 4   95
Teicoplanina      0,125    0,25 100      0,25      0,25 100    <0,06        1,125 100
Tetraciclina 32    128              23,2 1 64       41 32   64      45
Cloranfenicol 16    64        46,9 8 32          48,7 8 32      55

* Punto de corte según NCCLS para vancomicina: sensible: £4 µg/ml, intermedia 8-16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.
** Punto de corte según NCCLS para teicoplanina: sensible: £8 µg/ml, intermedia 16 µg/ml, resistente ³32 µg/ml.

 

DISCUSIÓN

En el año 1991 se inició la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos en cepas de Enterococcus spp en un hospital de Santiago, no habiéndose detectado a la fecha cepas de E faecalis resistentes a penicilina y ampicilina, manteniéndose incluso los valores de la CIM 50 y 90 similares a estudios anteriores. Por el contrario, en esa casuística se describió resistencia a penicilina y ampicilina en E faecium y otras especies, no existiendo diferencias significativas (p <0,05), al compararlo con los valores obtenidos en este estudio20. No existe siempre coincidencia en la susceptibilidad a penicilina y ampicilina siendo frecuentemente superior la actividad de ampicilina, como se demuestra en los datos obtenidos, con un valor cercano al 10% de diferencia. El mecanismo de resistencia estaría relacionado con una alteración de las PBPs, ya que no se encontraron cepas ß-lactamasa positivas. Con respecto a vancomicina y teicoplanina la susceptibilidad ha sido estable, lo que es importante por el rol progresivo que Enterococcus está adquiriendo en infección nosocomial, entre otros procesos infecciosos1,2. En relación a la resistencia a estos antimicrobianos es importante definir el fenotipo, entre los denominados vanA, vanB, vanC y vanD. De ellos, tendrían real importancia los fenotipos van A, con resistencia de alto nivel a vancomicina y teicoplanina y cuyo origen es plasmidial, y vanB con resistencia a vancomicina y susceptibilidad a teicoplanina, y tiene origen cromosomal. Ninguno de estos fenotipos de resistencia se confirmaron en las cepas de Enterococcus estudiadas. Es importante destacar el hallazgo de una resistencia intermedia a vancomicina y susceptibilidad a teicoplanina de una cepa de E casseliflavus, definiéndose ésta como fenotipo vanC, lo cual fue comprobado con la detección por PCR de los genes vanC1 y vanC2/3 y está calificada como una resistencia intrínseca no transferible21.

En enero de 1997, en Japón, se informó la primera cepa de S aureus de sensibilidad reducida a vancomicina (8 µg/ml), aislada de una herida operatoria en un niño sometido a cirugía cardíaca por atresia pulmonar14, y a fines de 1997, se aisló una cepa con las mismas características en Estados Unidos15. Hasta la fecha, en nuestro país no se han detectado cepas con resistencia a vancomicina. García y cols realizaron un estudio en S aureus meticilino resistente de origen intrahospitalario, en el cual uno de los objetivos fue estudiar la frecuencia de mutantes resistentes a vancomicina y teicoplanina. Los resultados indicaron ausencia de mutantes resistentes, detectándose una sensibilidad disminuida a teicoplanina y vancomicina al incubar la cepa con ambos antibióticos. La frecuencia de mutación fue de 3-6 x 10-10 lo cual hace plantear como posible la emergencia de una resistencia en cepas de SAMR22. Llama la atención la baja susceptibilidad a cotrimoxazol y rifampicina de SAMR, lo que ha ocurrido en el último período disminuyendo las alternativas terapéuticas. Staphylococcus aureus meticilino sensible ha mantenido su susceptibilidad a los antimicrobianos excepto a eritromicina (88%), manteniéndose como alternativa de tratamiento en pacientes ambulatorios con limitaciones en el uso de ß-lactámicos. En Staphylococcus coagulasa negativa se observa que el 50% de las cepas son susceptibles a oxacilina, existiendo disparidad en la interpretación de los resultados en relación a cefazolina, cuya susceptibilidad es 80%, situación que oscurece su proyección terapéutica. En general debiera considerarse que una cepa resistente a oxacilina, lo será también a las cefalosporinas de primera generación. También en S coagulasa negativa se observó una menor susceptibilidad a otros antimicrobianos, como ha sido comunicado en estudios nacionales y extranjeros12,13. Se obtuvo una disminución de la actividad de vancomicina y teicoplanina, lo que se expresa en CIM más elevadas. En Staphylococcus se han considerado varios mecanismos de resistencia a los glicopéptidos, entre ellos, sobreproducción o alteración en transpetidasas y transglicosilasas23; sobreproducción de proteína citoplasmática homóloga a NAD+, ligada a D-lactato dehidrogenasa24; aumento en la producción de proteínas ligantes de penicilina, PBP225 entre otras, sin embargo no existe una certeza del mecanismo real involucrado.

Los resultados indican la necesidad de mantener una vigilancia de la susceptibilidad de cocáceas grampositivas, con el fin de detectar oportunamente cepas con resistencia intermedia a los glicopéptidos, lo que podría ir en aumento en un futuro próximo, considerando los mecanismos de intercambio de información genética que pueden ocurrir entre diferentes géneros y especies de cocáceas y considerando que son una alternativa terapéutica frente a la resistencia de ß-lactámicos26.

Agradecimientos: Al Laboratorio Hoechst Marion Roussel, por el apoyo en esta investigación.

Correspondencia a: María Soledad Giglio M. Nibaldo Correa 833, Código Postal 6760800, Las Condes, Santiago, Chile.

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