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Parasitología al día

versión impresa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.24 n.3-4 Santiago jul. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07202000000300001 

Mantenimiento en cultivo y caracterización de un microsporidio 
(Encephalitozoon hellem) aislado en un paciente con Sida y neumonía


FERNANDO J. BORNAY-LLINARES*/**, BEATRIZ ACOSTA ***, JAVIER PEMAN***,
HERCULES MOURA**/****, DAVID A. SCHWARTZ*****, ALEXANDRE J. DA SILVA**,
GOVINDA S. VISVESVARA **, MARIA J. FIGUERAS******, MIGUEL GOBERNADO *** y
NORMAN J. PIENIAZEK **.

MANTAINED IN CULTURE AND CHARACTERIZATION OF A MICROSPORIDIAN (Encephalitozoon hellem) ISOLATED FROM AIDS PATIENT WITH NEUMONIA

We report the identification to the species level of a microsporidian isolated from the bronchoalveolar lavage of an AIDS patient in Spain. Characterization of the isolate was performed by: 1) morphological methods using optical and electron microscopy; 2) immunological methods such as immunofluorescence assay (IIF) and immunoblot (WB) using specific antiserum and, 3) polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primers designed on the coding region of the small subunit of the ribosomal RNA gene. Ultrastructural features allowed the identification of the isolate as belonging to the Encephalitozoon genus. Species identification as Encephalitozoon hellem was achieved by IIF and WB using polyc lonal rabbit serum anti-E. hellem (CDC:0291:V213), as well as, by PCR using EHELF/EHELR species-specific primers. The isolate has been named EHVS-96 and has been maintained for 3 years in Vero-E6 monolayers. This is the first isolation in culture and characterization of E. hellem in Spain.
Key words: Human microsporidiosis. AIDS. Encephalitozoon hellem. Culture.


INTRODUCCION

Los microsporidios son protozoos amitocondriales situados taxonómicamente en el Phylum Microsporidia.1 Se caracterizan por formar resistentes esporas que presentan en su interior una estructura peculiar denominada tubo o filamento polar, a través de la cual infectan las células susceptibles donde desarrollan su ciclo vital. Estos parásitos intracelulares son microorganismos ubicuos que parasitan una amplia variedad de animales incluido el hombre.2 Hasta el momento, han sido descritas casi 1.000 especies pertenecientes a más de 100 géneros;3 sin embargo, únicamente especies de ocho géneros (Brachiola, Encephalitozoon [Septata], Enterocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophora y Vittaforma) han sido asociadas a enfermedad en el hombre.4-6

La mayor parte de las microsporidiosis humanas ocurren en pacientes con Sida y se manifiestan de forma local o diseminada, presentando, al igual que sus agentes, una distribución cosmopolita. Enterocytozoon bieneusi es la especie más prevalente siendo causante de la inmensa mayoría de los casos causando afectación gastrointestinal y del árbol hepato-biliar,5, 6 aunque en tres ocasiones ha sido identificada en muestras respiratorias.7-9 La segunda especie en importancia es la descrita como Septata intestinalis10 y cuya posición taxonómica, dentro del género Encephalitozoon, ha sido recientemente propuesta.11 Es causante de entre el 10 y el 20% de los casos de gastroenteritis en pacientes con Sida y, al contrario que E. bieneusi, presenta una gran tendencia a producir infección diseminada.5, 6 Dentro del género Encephalitozoon,otras dos especies (E. hellem y E. cuniculi) causan infecciones generalmente diseminadas provocando conjuntivitis, sinusitis y afectación de los aparatos respiratorio y genitourinario.5, 6 E. cuniculi es parásito habitual de todas las clases de vertebrados2 y recientemente ha sido descrita la presencia de E. intestinalis en muestras fecales de varias especies de mamíferos;12 sin embargo, la infección por E. hellem en reservorios no humanos solo ha sido confirmada en aves.13-15

El diagnóstico de microsporidiosis se realiza mediante microscopía óptica y, hasta el desarrollo de los métodos inmunológicos y moleculares actuales, únicamente era posible identificar la especie mediante microscopía electrónica. Las características ultraestructurales de las esporas producidas por las especies incluidas en el género Encephalitozoon, son idénticas, aunque E. intestinalis puede ser distinguida de las otras especies por presentar una característica matriz fibrilar en la vacuola parasitófora donde ocurren los estadios de desarrollo de su ciclo vital.10 Las especies E. cuniculi y E. hellem presentan la misma morfología en todos sus estadios de desarrollo y sólo pueden ser identificadas mediante métodos bioquímicos, inmunológicos o moleculares.16

El presente estudio tuvo como objetivo identificar la especie del microsporidio del género Encephalitozoon aislado en cultivo celular a partir del lavado broncoalveolar (LBA) de un paciente con Sida, ingresado en el hospital La Fe de Valencia (España)..17

MATERIAL Y METODOS

Caso clínico

Enfermo homosexual de 41 años, con sida (CDC estadio, C3), desnutrición grave y lesiones cutáneas de sarcoma Kaposi, ingresado en el hospital por diarrea, astenia y disnea. En el estudio radiológico realizado en el momento de la admisión se observaron nódulos pulmonares compatibles con sarcoma de Kaposi. La broncoscopia evidenció un árbol bronquial mínimamente inflamatorio y ausencia de alteraciones histológicas compatibles con la supuesta alteración neoplásica. Los exámenes de laboratorio a su ingreso presentaron: linfocitos CD4 < 50/mm3; 41.000 plaquetas; 1,5 meq/L de potasio y 1.639 U/L de LDH. El estudio coproparasitológico demostró la presencia de ooquistes de Cryptosporidium sp.. Siete días después de la admisión la disnea empeoró y el paciente falleció. No fue permitido el estudio necrópsico. En el cultivo del lavado broncoalveolar recogido en el momento de la hospitalización, fue aislado citomegalovirus, detectándose posteriormente (día 18 del cultivo) el crecimiento de un microsporidio que fue identificado, mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión e inmunofluorescencia indirecta, como Encephalitozoon sp.17

Mantenimiento del aislado

A partir del cultivo inicial realizado en fibroblastos fetales humanos (MRC-5),17 se realizaron subcultivos en la misma línea celular y en células epiteliales de riñón de mono (Vero-E6), según métodos descritos previamente.18 El aislado se mantiene en cultivo desde el mes de abril de 1996.

Caracterización morfológica

icroscopía óptica (MO): Las esporas procedentes del cultivo fueron teñidas mediante la tinción tricrómica modificada19 y la tinción de quick-hot Gram-chromotrope.20

Microscopía electrónica de transmisión (MET): Un frasco de cultivo fue tripsinizado y procesado para estudio ultraestructural. Para ello y después de tres lavados en tampón fosfato (PBS), las células fueron fijadas durante 3 horas a 4ºC en una solución de glutaraldeído al 2,5% en tampón cacodilato (0,1 M, pH 7,4). Las muestras fueron deshidratadas en soluciones de etanol-óxido de propileno y embebidas en Epon. Se realizaron cortes ultrafinos que fueron contrastados con citrato de plomo (10 minutos) y acetato de uranilo al 2, 5% (10 minutos) y examinados en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM-900.

Caracterización inmunológica

Inmunofluorescencia indirecta (IFI): Periódicamente se colectaron esporas procedentes del medio de cultivo del aislado en estudio. Una vez centrifugadas, a 2.000 g y a 4ºC durante 20 minutos, el sedimento se lavó una vez con PBS, conteniendo Tween 20 al 0,3% y seguidamente con PBS libre de Tween 20. Las esporas fueron purificadas mediante un gradiente de Percoll, centrifugadas en las condiciones descritas y conservadas a 4ºC hasta su uso. La IFI se realizó fijando las esporas purificadas sobre portas de inmunofluorescencia y analizadas usando sueros policlonales de conejo anti-E cuniculi (CDC: V282),21 anti-E. hellem (CDC: 0291: V213)22 y anti-E. intestinalis (CDC: V297)23 a una dilución 1:400, seguido de IgG de cabra anti-conejo marcada con isotiocianato de fluoresceína según métodos publicados.18, 21-23 Las esporas procedentes de los aislados de referencia, a partir de los que se elaboraron los sueros policlonales utilizados, fueron utilizadas como controles y procesadas del modo descrito.

lectroforesis en gradiente de acrilamida e inmunoblot (WB): Las esporas procedentes de cultivo del aislado en estudio y de los aislados de referencia: E cuniculi (CDC: V282),21E. hellem (CDC: 0291: V213)22 y E. intestinalis (CDC: V297)23 fueron purificadas y conservadas a 4ºC hasta su utilización. Para extraer las proteínas de las esporas de los distintos cultivos, se preparó una suspensión de 5 x 106 esporas/ml en un tampón conteniendo 2,5% de SDS y 2,25 M de urea.16, 18 Las distintas suspensiones fueron sometidas a una temperatura de 65ºC durante 15 min. Las proteínas resultantes de la extracción fueron dispensadas en cada calle de 1,0 mm de un gel en gradiente del 2,5 al 27% de acrilamida (Isolab Inc. Akron, Ohio) y sometidas a electroforesis.18 Tras la separación, las proteínas fueron transferidas a una membrana de Inmobilon que fue seguidamente expuesta a suero policlonal de conejo anti-E. hellem (CDC: 0291: V213) diluido 1:5.000. Después de lavar adecuadamente, se dispensó IgG de cabra anti-conejo marcado con peroxidasa a una dilución 1:5.000 (Cappel Laboratories). Como sustrato y cromógeno se utilizaron peróxido de hidrógeno (3%) y diaminobencidina (0,005%) respectivamente.18

Caracterización molecular

Extracción del ADN: La extracción del ADN a partir del cultivo de células Vero-E6 infectado con el microsporidio aislado se realizó mediante disrupción con perlas de vidrio (Sigma G-9139, Glass beads, Trimethylsilyl-silanized, 140-270 mesh, Sigma Chemical Co) y tampón de digestión conteniendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 1% de lauryl alcohol poliéter (Laureth 12, PPG Industries Inc, Gurnee,Ill, USA) y Proteinasa K (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, USA) a la concentración final de 1 mg/ml, según métodos publicados.12, 24

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La caracterización del aislado se realizo utilizando iniciadores especie-específicos descritos previamente y diseñados a partir de la secuencia que codifica el ARN de la subunidad menor ribosomal de E. hellem, E. cuniculi y E. intestinalis, denominados EHELF/EHELR22, ECUNF/ECUNR22 y SINTF/SINTR23 respectivamente. Estos pares de iniciadores, producen amplicones diagnósticos de cada una de las especies sin presentar amplificación cruzada con las especies conocidas de microsporidios que infectan al hombre. La amplificación mediante PCR se realizó según condiciones previamente publicadas.22, 25 Como control negativo se utilizó ADN extraído de células Vero-E6 sin infectar.

RESULTADOS

Microscopía óptica. En el cultivo celular se observaron células parasitadas mostrando el característico aspecto "en mazorca de maíz" propia del crecimiento intracelular de los microsporidios (Figura 1A). La tinción tricrómica modificada mostró estructuras ovoides de color rosa a rojo (1,0-1,2 x 2,0-2,5 µm), algunas de las cuales presentaban la característica banda ecuatorial presente en las esporas de los microsporidios (Figura 1B). La tinción de quick-hot Gram-chromotrope tiñó estas estructuras de color violeta, algunas de ellas presentaban en su interior, además de la banda ecuatorial, gránulos gram positivos (Figura 1C). Las características morfotintoriales descritas son propias de esporas de microsporidios y compatibles con las del género Encephalitozoon19, 20.

Figura 1. Características morfotintoriales del aislado EHVS-96. A. Cultivo celular (MRC-5) mostrando la típica apariencia "en mazorca de maíz" (400x). B. Tinción tricrómica modificada: esporas (1.000x). C. Tinción de "quick-hot" gram-chromotrope: esporas procedentes de cultivo en células Vero-E6 (1000x).

Microscopía electrónica. La microscopía electrónica de transmisión reveló células infectadas, conteniendo esporas maduras y diferentes estadios evolutivos del parásito en el interior de vacuolas parasitóforas (Figura 2A y 2B). También se observaron esporoblastos, esporas maduras y esporas vacías en el medio extracelular. Las esporas maduras de forma ovalada y con un tamaño medio de 1,3 x 2,5 µm (rango 1,0-1,6 x 2,3-2,7 µm) presentaban una gruesa pared formada por una capa electrodensa (exospora), una gruesa capa electrotransparente (endospora) y una fina membrana plasmática rodeando el contenido de la espora (Figura 2D).

Las esporas contenían un único núcleo (Figura 2E) y un filamento polar que presentaba entre 4 y 6 vueltas, dispuestas generalmente en una única hilera (Figura 2F). Las características ultraestructurales descritas permiten identificar el aislado como perteneciente al género Encephalitozoon. Además, la ausencia de matriz extracelular entre las esporas contenidas en la vacuola parasitófora, característica de E. intestinalis, permitió excluir esta especie en el proceso de identificación.

Figura 2. Características ultraestructurales del aislado en cultivo celular (línea Vero-E6). A. Vacuola parasitófora conteniendo estadios iniciales de desarrollo en la periferia y esporas maduras libres en su interior. Nu: núcleo celular; Me: merontes; Et: esporonte; Eb: esporoblasto. B. Formas evolutivas. Me: meronte; Eb: esporoblasto en el que se aprecia el tubo polar con 6 vueltas dispuestas en una hilera. C. Esporas vacías. D, E y F. Detalles de las esporas maduras uninucleadas del aislado en estudio. Ex: exospora; En: endospora; Tp: tubo polar y Nu: núcleo.

Inmunofluorescencia. Las esporas reaccionaron únicamente con el suero anti-E. hellem (CDC: 0291: V213), empleado a la dilución 1:400 observándose una fluorescencia intensa al ser examinadas con un microscopio de epifluorescencia (Figura 3A).

Figura 3. Identificación específica del aislado EHVS-96. A. Inmunofluorescencia observada en esporas procedentes de cultivo celular con suero anti-E. hellem (CDC:0291:V213) (1.000x). B. Patrón de reconocimiento antigénico mediante Western blot usando suero policlonal de conejo anti-E. hellem (CDC:0291:V213) frente a extractos proteicos de esporas procedentes de cultivo en células Vero-E6 del aislado (calle 2) y de aislados de referencia: E. hellem (calle 1), E. cuniculi (calle 3) y E. intestinalis (calle 4). La calle 5 corresponde a un extracto de células Vero-E6 como control. El aislado presenta una banda de aproximadamente 25 Kda ausente en el aislado homólogo de referencia (flecha). C. Electroforesis en gel de agarosa mostrando los productos de amplificación obtenidos mediante PCR usando iniciadores especie-específicos para E. hellem. Calle 1: producto amplificado a partir del ADN extraído del cultivo celular infectado con el aislado en estudio. Calle 2: amplicón obtenido a partir de ADN clonado de la región que codifica el subunidad menor del ARN ribosomal de E. hellem. Calle 3: control negativo (ADN extraído de células Vero-E6). Calle 4 patrón 100-bp. Los números a la izquierda del gel indican el tamaño de los fragmentos de ADN en pares de bases.

Western blot. A pesar de que algunas de las proteínas extraídas de los aislados de las es-pecies heterológas presentan antígenos que son reconocidos por el antisuero utilizado (Figura 3B, calle 4) El análisis del aislado mediante WB, mostró un patrón de reactividad semejante al mostrado por el aislado de referencia E. he-llem (CDC: 0291: V213) (Figura 3B, calle 1). No obstante, el antisuero empleado reconoció con intensidad una banda de aproximadamente 25 KDa en la muestra procedente del aislado en estudio y no en el aislado de la especie homóloga utilizado como comparación. (Figura 3B, calle 2).

PCR. Mediante PCR se observó la amplificación de una banda diagnóstica de 547 pares de bases al emplear el par de iniciadores EHELF/EHELR (Figura 3C, calle 1). Una banda de idéntico tamaño fue amplificada a partir de ADN clonado correspondiente a la región que codifica la subunidad menor de ARN ribosomal de E. hellem que fue utilizado como control positivo(Figura 3C, calle 2). No se observó amplificación usando los iniciadores específicos para E. cuniculi y E. intestinalis, ni al usar ADN extraído de células Vero-E6 como control negativo (Figura 3C, calle 3)

DISCUSION

El diagnóstico de las microsporidiosis humanas puede resultar difícil por varias razones: los organismos son diminutos (las especies más comunes que infectan al hombre miden de 1 a 2,5 µm) y difícilmente observados en biopsias, preparaciones citológicas o muestras fecales mediante los métodos de tinción habituales; el examen ultraestructural mediante microscopía electrónica no es práctico y frecuentemente no está disponible; además, los métodos de detección de anticuerpos descritos no son útiles como indicadores de infección activa. Actualmente, el desarrollo de nuevos métodos de tinción: tricrómico modificado,19 marcadores quimioluminiscentes,26 gram-chromotrope20 permiten el diagnóstico de microsporidiosis en todo tipo de muestras clínicas. Sin embargo, la identificación de las especies de microsporidios requiere el empleo de métodos que sólo se encuentran disponibles en laboratorios especializados. En este estudio, presentamos la identificación como Encephalitozoon hellem del primer microsporidio patógeno humano aislado en cultivo en España.

Desde la descripción de E. hellem como nueva especie,16 se han comunicado 24 casos de infecciones humanas causadas por esta especie, afectando todas ellas a pacientes con SIDA y residentes en: USA (10 casos),16, 22, 27-35 Italia (9 casos),36-39 Suiza (3 casos),40,41 Gran Bretaña (1 caso)42-45y Tanzania (1 caso).46El diagnóstico inicial, se realizó en todos ellos tras la observación de esporas en exudado conjuntival y/o biopsia corneal o conjuntival,27-31, 34, 35, 38, 40, 42, 44 exudado nasal y/o biopsia de mucosa nasal,34, 42, 44, 46 lavado orofaríngeo,36, 38 esputo,31, 33, 34, 39, 40 lavado broncoalveolar,17, 31, 37-39 biopsia bronquial31 y orina.18, 22, 33-36, 38, 40, 41 El parásito fue aislado en cultivo celular en 19 ocasiones y diferentes líneas celulares se mostraron útiles para este propósito, especialmente, células de epitelio renal de mono (Vero-E6),17, 18, 22, 29, 31, 36, 38, 42 de perro (MDCK),16, 18, 36, 38, 40, 45 de conejo (RK13),35 fibroblastos fetales humanos (MRC-5)17, 18, 22, 29, 36-39, 46 o bovinos (PV-3-93).36-39

La identificación del género se realizó, como en este caso, mediante microscopía electrónica de transmisión en 21 de los pacientes, tanto a partir de muestras clínicas27-30, 33, 34, 38, 40, 42, 44 como de cultivo celular.16-18, 21, 31, 36-38, 40, 45, 46 La semejanza morfológica entre E. hellem y E. cuniculi hace necesario el empleo de métodos inmunológicos o moleculares para la identificación al nivel de especie. De este modo E. hellem fue identificado mediante IFI (11 pacientes),22, 29-37, 40 WB (18 pacientes)16, 22, 36-39, 41, 45 y PCR (15 pacientes).22, 35-39, 41, 46 Cualquiera de los métodos descritos permite la identificación de especie y en el caso que aquí se presenta, los tres métodos de identificación empleados (IFI, WB y PCR) mostraron inequívocamente, que el microsporidio aislado pertenece a la especie E. hellem. El aislado ha sido denominado EHVS-96 (Encephalitozoon hellem, Valencia, Spain-1996) y se mantiene en cultivo desde abril de 1996.

Se desconoce el reservorio natural y la fuente de infección de E. hellem, pero existen evidencias apoyando la posibilidad de que la infección sea adquirida por vía aérea. Hallazgos histopatológicos en pacientes infectados por E. hellem mostraron un patrón de colonización del árbol traqueobronquial compatible29 y la presencia de parásitos en los espacios alveolares29 y en las células epiteliales de los bronquiolos terminales.31 Por otro lado, la observación de infección diseminada asintomática con presencia del parásito en vías respiratorias40 y la reciente descripción de 3 nuevos casos de colonización exclusivamente pulmonar por esta especie,39 aportan nuevas evidencias sobre la adquisición de la infección por vía respiratoria y su posterior diseminación hematógena hacia otros órganos. Es más, la presencia de esta especie de microsporidio en el aparato digestivo o en muestras fecales en pacientes con microsporidiosis, nunca ha sido descrita.

El paciente portador del microsporidio aislado, falleció a causa de un cuadro de insuficiencia respiratoria aguda. La presencia del parásito en otras localizaciones no pudo realizarse debido a que el diagnóstico de microsporidiosis fue realizado postmortem. Las manifestaciones clínicas con mayor frecuencia observadas en los pacientes infectados por E. hellem, fueron cuadros oculares (16 casos).16, 22, 27-30, 33, 38, 40, 42, 43 Seis de estos pacientes presentaron cuadros de sinusitis y/o rinosinusitis.22, 8-31, 38, 42, 43 El carácter diseminado de la infección se confirma al observar en la mayoría de los pacientes la presencia simultánea del parásito en muestras clínicas de distinta procedencia, especialmente orina y muestras respiratorias.29, 32, 33, 35, 36, 38, 40 Trece de los pacientes presentaron sintomatología respiratoria con tos, disnea y un patrón radiológico con infiltrado intersticial.17, 31, 36-38, 46 Aunque sólo 5 de los pacientes en los que el parásito fue detectado en orina, cursaron con infecciones sintomáticas del tracto urinario,29, 33, 38, 41 tres de ellos terminaron en fracaso renal.29, 33, 38 En la mayoría de las ocasiones se identifican otras infecciones oportunistas concomitantes: Cytomegalovirus,14, 29, 33, 36 Vitta-forma corneae,46 Cryptosporidium sp.,17Pneumocystis carinii,26, 29, 34, 35, 38 Cryptococcus neoformans,25Mycobacterium tuberculosis,34, 35 Mycobacterium avium-intracelulare,29Treponema pallidum17, 28 etc, por lo que el diagnóstico de una o varias de ellas, no permite descartar la coinfección con E. hellem.

La escasez de datos epidemiológicos acerca de las infecciones por microsporidios en España es comprensible, pues son escasos los hospitales y grupos de investigación que realizan el diagnóstico de microsporidiosis. La descripción de nuevas técnicas de tinción, de ejecución sencilla y rápida, como la de "quick-hot" gram-chromotrope,20 deben facilitar la detección de estos patógenos emergentes, mediante examen directo, al menos en casos seleccionados. Varios hospitales utilizan rutinariamente medios de cultivo celular para aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Entre las líneas celulares más empleadas se encuentra la  MRC-5, que permite el desarrollo de microsporidios de manera eficaz y rápida32, 34 y por ello sea quizás una de las indicadas para el aislamiento primario. Consideramos por ello recomendable, mantener y observar periódicamente los cultivos durante un periodo de 30 días y, en caso de observarse efectos citopáticos inusuales, proceder a investigar la posible presencia de microsporidios.

El tratamiento de las infecciones humanas causadas por microsporidios del género Encephalitozoon (E. hellem, E. cuniculi y E. intestinalis) con albendazol resulta efectivo en la mayoría de los casos y la identificación del género es suficiente para adoptar una actitud terapéutica correcta.5, 18, 31 A pesar de ello, el aislamiento en cultivo de diferentes aislados, puede permitir la identificación de nuevas especies, la investigación in vivo e in vitro de nuevos fármacos y el desarrollo de métodos inmunológicos y moleculares de aplicación en el diagnóstico clínico y en el estudio de la epidemiología de las microsporidiosis.

RESUMEN

Comunicamos la identificación, a nivel de especie, de un microsporidio aislado en cultivo celular a partir de un lavado broncoalveolar de un paciente con Sida y neumonía. La caracterización del aislado se realizó mediante: 1) estudio morfológico utilizando métodos de microscopía óptica y electrónica, 2) estudio inmunológico con antisueros específicos, inmunofluorescencia indirecta (IFI) e inmunoblot (WB) y 3) estudio molecular tras reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores especie-específicos diseñados a partir de la región que codifica la subunidad menor del ARN ribosomal. Las características ultraestructurales del aislado permitieron su identificación en el género Encephalitozoon. La identificación específica del microsporidio como Encephalito-zoon hellem se realizó mediante IFI y WB, empleando suero policlonal de conejo anti-E. hellem (CDC:0291:V213), y mediante la amplificación por PCR del fragmento diagnóstico utilizando el par de iniciadores EHELF/EHELR específicos para esta especie. El aislado ha sido denominado EHVS-96 y se mantiene en cultivo continuo en células Vero-E6. Este es el primer aislamiento en cultivo y caracterización de E. hellem en España.
___________________
Agradecimientos: FJ Bornay-Llinares ha sido financiado parcialmente por la beca SEIMC-Bayer 1996 y por AKRALAB S.L. Alicante. H. Moura recibe una beca posdoctoral del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.

* División de Parasitología e Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández
de Elche, Alicante.
** Division of Parasitic Diseases. National Center of Infectious Diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA. *** Servicio de Microbiología. Hospital Universitario La Fe, Valencia. **** Faculdade de Ciencias Médicas. Universidade Estadual do Rio de Janeiro y Laboratorio de Parasitología. Fundaçâo Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil. ***** Departments of Pathology and Medicine (Infectious Diseases), Emory School of Medicine, Atlanta, GA, USA.****** Unitat de Microbiología, Universitat Rovira i Virgili, Reus, Tarragona.

Correspondencia:
Fernando J. Bornay-Llinares
División de Parasitología.
Universidad Miguel Hernández de Elche.
Campus de San Juan. Apartado 18. 03550.
San Juan (Alicante), España.
Teléfono: 34-96-5919513 Fax: 34-96-5919457
e-mail: f.bornay@umh.es

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