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Boletín chileno de parasitología

versión impresa ISSN 0365-9402

Bol. chil. parasitol. v.55 n.1-2 Santiago ene. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-94022000000100005 

Utilidad diagnóstica de ELISA IgG, IgM, IgA y Elisa avidez de IgG
en toxoplasmosis reciente y crónica

María del C. Contreras, Lea Sandoval, Patricia Salinas, Paula Muñoz y Susana Vargas

Programa de Parasitología. ICBM. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Casilla 9183. Santiago, Chile.

Abstract

Diagnostic utility of ELISA IgG, IgM, IgA and ELISA IgG avidity in recent and chronic toxoplasmosis

Toxoplasmosis, a world-wide zoonotic infection, is generally asymptomatic and benign in immunocompetent individuals, but it can be serious in immunodeficiencies particulary in patients with acquired immunodeficiency syndrome and in children infected in utero. So, it is important to dispose methods which permit discriminate between recent and chronic infections.

In order to contribute to improve the diagnosis of toxoplasmosis ELISA IgG, IgM, IgA and ELISA IgG avidity were performed in 15 and 24 sera from patients suspected of having acute and chronic infection respectively, according dye test (DT) titres.

ELISA IgG was positive in both groups, ELISA IgM was positive in 78.6 and 58.3% respectively, while ELISA IgA was positive in 85.7 and 33.3% of recent and chronic group respectively. In those sera with low IgG avidity ( 18.8%) we found specific IgM in 71.5 and 4.2% and IgA in 78.6 and 0.0% of recent and chronic groups respectively.

Parallely, 208 sera samples were clasified according to the results of DT, indirect hemagglutination and complement fixation tests in the following groups: acute (97), intermediate (36), chronic (35) and negative (40). The results were: acute (96.9-64.9-55.6 and 65.9%); intermediate (97.2-63.8-44.4 and 47.2%); chronic (45.7-42.8- 5.7 and 34.3%) for IgG, IgM, IgA and low IgG avidity respectively.

The use of both acute markers, IgA and low IgG avidity in the diagnosis of toxoplasmosis is discussed.

Palabras clave (Key words): toxoplasmosis; inmunodiagnóstico (immunodiagnosis); ELISA IgG; ELISA IgM; ELISA IgA; ELISA avidez de IgG (ELISA IgG avidity).

INTRODUCCION

La toxoplasmosis es una infección parasitaria cosmopolita de alta prevalencia, estimándose que cerca del 40% de la población mundial está parasitada (Heyneman y Mc Karrow, 1987). En Chile, en un estudio reciente se encontró una seroprevalencia del 36,9% (Contreras y col., 1996). Generalmente asintomática y benigna en el individuo inmunocompetente, puede ser grave en el paciente inmunocomprometido y en los niños infectados por vía transplacentaria (MC Cabe y Remington, 1990).

Debido a que la gran mayoría de los infectados son individuos que están en la etapa crónica, la diferenciación entre aguda y crónica es de gran importancia clínica, lo cual siempre plantea la necesidad del uso de métodos sensibles, rápidos y de fácil ejecución, tanto para el diagnóstico como para su seguimiento y control.

Con los primeros métodos utilizados -que detectan principalmente IgG- sólo la seroconversión ofrecía un diagnóstico claro de infección aguda, la cual también puede ser identificada mediante la realización de una curva serológica, la detección de marcadores específicos de infección reciente (IgM, IgA), la antigenemia y más recientemente la avidez de los anticuerpos IgG. Esta técnica permite la detección de anticuerpos IgG de baja avidez, propios del período agudo, por su antígeno específico, diferenciándolos de aquellos de alta avidez propios del período crónico. En todos estos casos es indispensable la interpretación clínica y serológica correcta (Contreras, 1990; Wilson y Mc-Auley, 1991).

El presente trabajo ha tenido por objetivo evaluar la utilidad diagnóstica de la detección de inmunoglobulinas específicas (IgG, IgM e IgA) mediante ELISA indirecta y la avidez de IgG por su antígeno específico, como posibles marcadores del período agudo y su comparación con las técnicas de rutina utilizadas en nuestro laboratorio: reacción de Sabin y Feldman (RSF), reacción de hemaglutinación indirecta (RHAI) y reacción de fijación del complemento (RFC).

MATERIAL Y METODOS

1.- Sueros empleados.

Se utilizaron 250 muestras de suero de 176 pacientes con sospecha clínica de toxoplasmosis, provenientes de distintos hospitales y policlínicas de la Región Metropolitana y otras regiones del país. Los sueros fueron inactivados a 56°C por 30 minutos y una vez realizadas las técnicas de rutina de RSF, RHAI y RFC se conservaron diluidos 1:1 en bufer glicerina fosfato pH 8,0 a -20ºc.

De estos sueros seleccionados, se escogieron:

a) 15 correspondientes a pacientes representativos de infección reciente (R) con títulos para RSF 16000 y 24 de pacientes con infección crónica (C) que eran sueros de seguimientos con títulos de RSF 4000 estables o en descenso a través del tiempo.

b) 208 muestras distribuidas en los siguientes cuatro grupos:

Grupo 1.- Agudos. 97 sueros que presentaron discordancia* de títulos entre la RSF y la RHAI.

Grupo 2.- Intermedios. 36 sueros concordantes en los títulos de la RSF y la RHAI 256.

Grupo 3.- Crónicos. 35 sueros concordantes en los títulos de la RSF y la RHAI 256 y la RFC negativa.

Grupo 4.- Negativos.40 sueros negativos para las tres reacciones.

* Se consideraron sueros discordantes aquellos que presentaron variación entre el título de la RSF y el de la RHAI en más de una dilución (cuádruple) hasta la dilución 1:64, o si a partir de la dilución 1:256, existió variación en más de una dilución (Knierim y col. 1980).

2.- Preparación del antígeno.

Los trofozoítos de Toxoplasma gondii se obtuvieron de exudado peritoneal de ratones con tres días de infección. El exudado resultante, diluido 1:1 en buffer fosfato salino pH 7,2, se pasó por jeringa 18-20 veces para ocasionar la ruptura de los macrófagos existentes y permitir la liberación de los taquizoítos. Las células contaminantes en el exudado fueron removidas mediante centrifugación a 3000 rpm por 30 minutos a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y se pesó el pellet obtenido para luego diluirlo 1:5 en agua destilada, pasándolo nuevamente por jeringa 18-20 veces, dejándolo a 4°C por 24 horas. Se inició un ciclo de congelación (-20°C) y descongelación a temperatura ambiente, repetido 7 veces. Posteriormente, se centrifugó a 3000 rpm por una hora a 4°C. La concentración proteica del sobrenadante determinada por el método de Bradford (1976) fue de 4 mg/ml.

3.- Técnicas utilizadas.

-RSF.- Según método de Sabin y Feldman (1948).

-RHAI.- Según técnica modificada por Contreras y col. (1978).

-RFC.- Según método del 50% de hemólisis de Bozicevich, modificado por Knierim (1958).

-ELISA indirecta para IgG, IgM e IgA.- Se utilizaron 10 µl de antígeno de T.gondii -diluido en buffer carbonato-bicarbonato pH9,6- para sensibilizar placas de fondo plano (Corning®). Las concentraciones utilizadas para la detección de IgG, IgM e IgA específicas, fueron de 1, 2 y 5 µg/ml, respectivamente. Luego de incubar a 37°C por dos horas, se lavaron las placas con el buffer PBS 0,01 M pH 7,2 Tween 20 a una concentración del 0,05% (PBS-T) cuatro veces por 5 minutos bajo agitación constante. Posteriormente, se bloquearon las placas a 37°C por una hora con una solución de leche descremada al 3% en PBS-T, eliminándose el líquido y guardándose a -20°C hasta su uso.

Se depositaron por duplicado 100 µl de lo sueros diluidos al 1:10 en leche descremada PBS-T, para luego incubar las placas a 37°C por una hora. Luego del lavado en las condiciones ya descritas, se agregaron 100 µ de los respectivos conjugados, anti IgG, anti IgM y anti IgA humanas-peroxidasa (Sigma®) a diluciones óptimas obtenidas de titulaciones previas, las cuales fueron de: 1:10.000, 1:20.000 y 1:10.000 para IgG, IgM e IgA respectivamente, procediéndose a incubar en las condiciones ya indicadas.

Se agregaron 100 µl de sustrato (0,04% ortofenilendiamina en buffer citrato pH 5,0 y 0,04% v/v de H2O2 al 30%), incubándose a temperatura ambiente y en oscuridad durante el tiempo previamente determinado (15 minutos para IgG y 45 minutos para IgM e IgA), luego de lo cual la reacción fue detenida con 100 µl de H2 SO4 8N.

La cantidad de color producto de la reacción enzimática se determinó mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 42 nm en un espectrofotómetro Dynatech MR250.

Los sueros con valores de corte mayores que las DO definidas previamente fueron considerados positivos. Dichos valores fueron de: 0,250 (IgG) 0,233 (IgM) y 0,198 (IgA).

-ELISA indirecta para avidez de IgG.- Se procesó bajo las mismas condiciones de la ELISA indirecta IgG, basada en el método utilizado por Hedman y col. (1989), modificado por Jenum y col. (1997) y adaptado a este trabajo. Cada muestra fue procesada en duplicado, utilizándose 100 µl de las siguientes diluciones: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 y 1:3200 en leche descremada al 3% en PBS 0,01M con 0,02% de Tween 20, para luego incubar por una hora a 37°C. Posteriormente, se efectuaron 4 lavados en uno de los duplicados en la forma ya descrita. En el otro duplicado, los tres primeros lavados se realizaron con úrea 6M (en PBS-T), y el último, sin úrea con el radicional buffer PBS-T. Las etapas restantes se desarrollaron de acuerdo a lo previamente descrito para ELISA indirecta IgG.

A cada muestra se le determinaron los títulos de IgG sin úrea, de acuerdo a Jenum y col. (1997).

Previamente se definió el límite para determinar si una infección era reciente (R) o crónica (C), el cual fue de 18,8% de avidez.

4.- Análisis estadístico.

Análisis de asociación de controles y muestras.- Para definir presencia o ausencia de asociación (dependencia) entre las diferentes reacciones, se utilizó la distribución Chi cuadrado (X2), aplicando la "Prueba de Asociación", considerando un p < 0,05 como estadísticamente significativo.

RESULTADOS

El estudio de la asociación de los sueros R y C permitió definir si existió dependencia entre la presencia de IgG, IgM e IgA específicas, determinadas mediante ELISA indirecta, e relación a la etapa de la infección, observándose que no hubo asociación (p > 0,05) entre presencia de IgG y duración relativa de la infección, ya que ésta fue positiva tanto en los sueros R como en los C.

En la Tabla I se muestra que la presencia de IgM específica no presentó diferencia con los grupos de sueros R y C (p > 0,05), estando presente en el 78,6% de las infecciones recientes y en el 58,3% de las crónicas. Nueve de los 14 sueros C que resultaron positivos, pertenecían a seguimientos, y por ende, fue posible establecer en tales casos, el tiempo aproximado de permanencia de la IgM, que osciló entre 4 y 35 meses con un promedio de 16.

TABLA I

Presencia de anticuerpos específicos IgM e IgA,
detectados mediante ELISA indirecta, en 14
sueros de pacientes con infección reciente y en 24
sueros con infección crónica.

Infección
Nº sueros
exami-
IgM posi-
tivos
 IgA posi-
tivos 
 


 
 
%
%

Reciente
14
11
78,6
12
85,7
 
 
 
 
 
 
Crónica
24
14
58,3
8
33,3

 

En cuanto a la IgA específica, esta presentó asociación (p < 0,05) con respecto a la duración relativa de la infección, de modo que la probabilidad de encontrarla en infecciones recientes fue mayor que en las infecciones crónicas. En 5 de los 8 sueros de infección crónica con IgA positiva, fue posible determinar el tiempo aproximado de permanencia, observándose un rango entre 4 y 35 meses con un promedio de 17 de persistencia.

En la Tabla II se visualiza que los títulos de la IgG, obtenidos mediante ELISA indirecta modificada para avidez frente a sueros R y C, presentaron asociación (p < 0,05) respecto l tiempo relativo de infección, mostrando una tendencia hacia la obtención de títulos altos de avidez de IgG en infecciones recientes.

TABLA II

Títulos de IgG en sueros de pacientes con
infección reciente y con infección crónica.

Infección Mínimo Maximo Promedio Mediana

Reciente 15 3138 1000 663
         
Crónica 3 1923 354 206

En la Tabla III se muestra que el porcentaje de avidez de IgG observado en sueros de pacientes con infección R y C presentó dependencia de la duración relativa de la infección (p < 0,05), con un promedio de avidez de 7,4% para sueros R y de 36,5% para sueros C.

TABLA III

Porcentajes de avidez en sueros de pacientes con
infección reciente y con infección crónica.

Infección
Mínimo
Maximo
Promedio
Mediana

Reciente
0,01
20
7,4
6,9
 
Crónica
17,3
100
36,5
35,6

 

En la Tabla IV se observa la relación entre los resultados de ELISA positiva para IgM e IgA respecto al porcentaje de avidez. Se detectó IgM en un 71,5% de los sueros R y en un 4,2% en los C, en aquellos sueros con un porcentaje de avidez bajo. resalta el hecho de que la IgA específica fue positiva en un 78,6% de los sueros R, en tanto que no se la detectó en los C.

TABLA IV

Resultados de la ELISA IgM y de la ELISA IgA para toxoplasmosis, según porcentaje
de avidez de IgG, en sueros de pacientes con infección reciente y con infección crónica.

 
 
Avidez = 18,8%
Avidez = 18,8%  

 
Nº sueros
          ELISA positiva          
          ELISA positiva          
Infección
examinados
IgM
IgA
IgM  
IgA  
 
 


 
 
%
%
%
%

Reciente
14
10
71,5
11
78,6
1
7,1
1
7,1
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Crónica
24
1
4,2
0
0,0
12
54,2
8
33,3

 

En la Tabla V se analiza la relación de los 208 sueros, agrupados según los criterios descritos previamente, con la detección de las tres clases de inmunoglobulinas específicas.

TABLA V

Resultados serológicos mediante ELISA indirecta IgG, IgM e IgA para toxoplasmosis, en 208 muestras de
sueros clasificados según criterios basados en los resultados de la RSF, la RHAI y la RFC

 
 
ELISA positiva 
Clasificación
Nº sueros

 
examinados
IgG
IgM
IgA 
   
 
 
%
%
%

Agudos
97
94
96,9
63
64,9
54
55,6
 
 
 
 
 
 
 
 
Intermedios
36
35
97,2
23
63,8
16
44,4
 
 
 
 
 
 
 
 
Crónicos
35*
16
45,7
15
42,8
2
5,7
 
 
 
 
 
 
 
 
Negativos
4
0
0,0
20
50,0
0
0,0

* De los sueros clasificados como crónicos, 14 de ellos fueron negativos para las tres inmunoglobulinas correspondientes a títulos 4 y 16 para la RSF.

 

En la Tabla VI se presentan los títulos de IgG y los porcentajes de avidez ( 18,8%) en 168 muestras de sueros de pacientes en diferentes etapas de la infección toxoplasmósica.

TABLA VI

Resultados serológicos de ELISA indirecta
modificada para avidez de IgG de 168* muestras
de sueros clasificados según criterios basados en
los resultados de la RSF, la RHAI y la RFC.

Clasificación
Nº sueros
Título IgG
Avidez = 18,8%  
 
examinados
Promedio
Mediana
%

Agudos
97
789
199
64
65,9
 
 
 
 
 
 
Intermedios
36
571
348
17
47,2
 
 
 
 
 
 
Crónicos
35
75
8
12
34,3

DISCUSION

La infección por T.gondii puede producir consecuencias potencialmente serias y a veces letales para fetos e inmunocomprometidos (Mac Cabe y Remington, 1990). Ante esto, se hace necesaria la búsqueda de técnicas simples que permitan un diagnóstico serológico rápido y confiable de infección reciente.

De los resultados obtenidos, en el presente trabajo, y al igual que otros autores, se observó que la respuesta tanto por RSF como por RFC, está dada principalmente por anticuerpos IgG (Bannister, 1982; Conteras, 1990), destacándose la mayor presencia de IgG e IgA junto con una baja avidez de IgG a títulos altos de ambas reacciones. La respuesta por RHAI, también estaría dada fundamentalmente por IgG (Apt, 1988; Contreras, 1990), y a títulos altos predominaría la presencia de IgA e IgM junto a una baja avidez de IgG. Por lo descrito, altos títulos de RSF y RHAI podrían ser interpretados como propios de infección reciente (Bannister, 1982). Sin embargo, de acuerdo a Apt (1988), también podrían ser encontrados en reactivaciones, lo que los hace no tan confiables como marcadores de infección reciente, si no son apoyados por otras técnicas.

La técnica de ELISA indirecta permitió encontrar IgG específica independientemente de los títulos de las reacciones de rutina. No obstante, títulos bajos, tales como 4 y 16, en muchos casos no fueron detectados por ELISA. Esto podría explicarse por el hecho de que la dilución utilizada en la técnica fue de 1:10 y por lo tanto, un título 4 podría no ser detectable. Otra explicación podría estar orientada hacia lo descrito por Suzuki y col. (1988), quienes observaron que los anticuerpos IgG reconocen distintos antígenos a lo largo de la infección, lo que se traduce en diferentes especificidades de estos según la etapa en que esta se encuentra, primeramente dirigidos hacia antígenos de membrana y luego hacia antígenos citoplasmáticos. De lo último se desprende que la preparación antigénica usada (antígeno citoplasmático) podría no reaccionar con todas las IgG presentes en los distintos sueros, especialmente en las primeras en ser sintetizadas.

Por lo observado, la IgG sería un buen marcador de infección, pero su presencia no permitiría definir el tiempo relativo de esta con las técnicas actualmente utilizadas. Pese a ello, el hallazgo de títulos altos ( 2000) o en incremento, permitiría orientar hacia el diagnóstico serológico de una infección reciente (Camargo y col., 1991).

La presencia de IgM específica no resultó propia de infecciones recientes, pudiendo además encontrarse en un alto porcentaje (58,3%) en las infecciones crónicas, lo que también ha sido descrito por otros autores (Brooks y col., 1987; Stepic-Biek y col., 1990; Gross y col., 1992; Lapalainen y col., 1993; Patel y col., 1993; Holliman y col., 1994; Gorgievski.Hrisoho y col., 1996), quienes observaron su prolongada persistencia en el tiempo, dependiendo de la sensibilidad de la técnica empleada y la respuesta inmune individual, por lo cual debe ser interpretada junto a otros marcadores de infección. Sin embargo, su utilidad no puede descartarse completamente ya que su ausencia podría, en algunos casos, excluir el diagnóstico de toxoplasmosis aguda.

La IgA fue la única inmunoglobulina, entre las estudiadas, cuya sola presencia orientó hacia una infección reciente. Según nuestros resultados, y al igual que lo observado por Patel y col. (1993), la IgA determinada mediante ELISA, está asociada con la infección aguda por T.gondii, ya que se detectó en el 85,7% de las mismas. Sin embargo, está presente en el 33,3% de las infecciones crónicas. De estas, más de la mitad correspondió a IgA con más de 12 meses de duración, similar a lo observado por otros autores (Lappalainen y col., 1993; Holliman y col., 1994), por lo cual no debería ser usada como único marcador para el diagnóstico de infección reciente. La ausencia de IgA obtenida en sueros negativos y a títulos 4 y 16 para RSF, podría ser explicada por la baja probabilidad de abarcar el período inmediatamente posterior al primer contacto con el parásito en las muestras estudiadas y también por el antígeno usado.

Por otro lado, el porcentaje de avidez de IgG, podría diferenciar infecciones recientes de las crónicas, al utilizar como límite un porcentaje de avidez menor o igual a 18,8%. El promedio del porcentaje de avidez obtenido par sueros R (7,4%), resultó semejante al encontrado por Jenum y col. (1994) para sueros con menos de 20 semanas de infección (5,9%). Aunque el promedio de sueros C (36,9%) resultó no tan comparable al 51,3% observado por los mismos autores para sueros de infección crónica, es lo suficientemente lejano al promedio encontrado para sueros correspondientes a infección reciente. Cabe destacar que lo porcentajes obtenidos en la determinación de avidez de IgG superiores al límite representativo de infección reciente (18,8%), no representan necesariamente una infección crónica y menos aún puede relacionarse su magnitud como directamente proporcional a la duración de la infección. La importancia de la determinación de avidez de IgG radica en que puede proveer evidencia complementaria y contribuir a un diagnóstico confirmatorio de infección aguda y según lo descrito por Holliman y col. (1994), permitiría distinguir reactivaciones a partir de una sola muestra, evitando así retrasos en el diagnóstico o tratamientos innecesarios.

La observación de resultados contradictorios, como la presencia de IgM e IgA en infecciones crónicas e infecciones recientes con alta avidez, sugiere que quizás la unión de ellos en un solo criterio lograría una mejor definición del tiempo relativo de infección. Así, se obtuvo que un resultado IgA positivo acompañado de una baja avidez de IgG presentaría menor sensibilidad (78,6%), aunque mayor especifidad (100%) para la detección de infecciones recientes, al ser comparado con los valores alcanzados separadamente por ada uno de los marcadores involucrados. La IgM, junto a una baja avidez de IgG, en cambio, no superó la sensibilidad lograda por la IgA, además de entregar una sensibilidad también inferior (95,8%).

Así, los resultados obtenidos para la determinación de IgA específica, en conjunto con la medición de avidez de IgG, lograron la máxima especificidad en la detección de una infección reciente, por lo tanto, se les considera útiles como criterios adicionales para el diagnóstico de infección aguda.

Por otra parte, al analizar los resultados obtenidos para los casos agudos, definido sobre la base e los resultados de las reacciones tradicionales, pudo observarse que esta definición no permitió agrupar exclusivamente los sueros que correspondían a una infección reciente; no obstante, los sueros alcanzaron un 65,9% de positividad para una avidez inferior al 18,8% establecida como límite y mostraron una importante presencia de IgM e IgA con un 64,9 y 55,6% respectivamente. Sin embargo, estas inmunoglobulinas no permitieron discernir entre los grupos agudos e intermedios, ni tampoco la determinación de avidez de IgG "d 18,8% en que se obtuvo un 47,2%, permitió diferenciarlos.

En el grupo de los casos crónicos se observó una baja presencia de IgA, obteniéndose un 34,3% de avidez de IgG ( 18,8%) junto con una disminución del promedio del título de IgG. Esto podría explicarse sobre la base de una clasificación errónea de los sueros que pertenecieron a esos grupos, es decir, se pudo haberse incluido sueros que estaban en el ascenso de la curva seriológica, y por coincidir con algún título considerado en esta clasificación, haber sido incorporados erróneamente. En resumen, los criterios basados en las técnicas RSF, RHAI y RFC no presentaron una clara y precisa definición de infección aguda y crónica.

Para definir cual sería el mejor criterio a usar, debiese ser considerada la finalidad de este, puesto que no son lo mismo los estudios seroepidemiológicos o la confirmación de una infección reciente, por ejemplo, en embarazadas. En el primer caso, sería necesaria una técnica de alta sensibilidad, por ejemplo ELISA. En el segundo caso, sería de utilidad la realización de una técnica de ELISA, o la reacción de inmunofluorescencia indirecta junto con la detección de IgA y la determinación de avidez de IgG específica por ELISA modificada.

REFERENCIAS

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