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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.131 n.6 Santiago jun. 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003000600004 

Determinación de células
peroxidasa positivas en líquido
seminal: ¿es un parámetro confiable
para el diagnóstico de infección
genital asintomática?

Raúl Sánchez G1,2, Juana Villegas M1,3a, Patricio Peña S1-4a,
Werner Miska5b, Wolf-Bernhard Schill5.

Determination of peroxidase positive
cells in semen for the diagnosis of
silent genital infections

Background: The presence of leukocytes, detected by peroxidase test in semen, can be a good indicator of infections in the male genital tract. Peroxidase positive cells have been positively correlated with elevated values of elastase, one of the major proteases liberated by granulocytes at the inflammation place. However, seminal granulocytes may not be adequately detected by the peroxidase test in comparison with immunological methods. Aim: To correlate the determination of peroxidase positive cells with the elastase level in the seminal plasma. Material and methods: Seminal plasma from 64 patients with a high number of round cells (>106/ml) in semen, was studied. Correlation analysis was done using the Pearson correlation coefficient. Results: No correlation between the level of granulocyte elastase and the number of peroxidase positive cells (r=0.2237, p >0.05), or even the number of round cells (r=0.03934, p >0.05) was observed. Conclusions: Our results suggest that the determination of peroxidase positive cells is not a reliable indicator of leukocytes in the seminal plasma and their absence do not discard a silent genital tract infection (Rev Méd Chile 2003; 131: 613-616).

(Key Words: Urogenital diseases; Infertility, male; Semen)

Recibido el 15 de noviembre, 2002. Aceptado en versión corregida el 13 de mayo, 2003.
Trabajo financiado por proyecto FONDECYT 1010729/7010729-2001.
1Centro de Biotecnología en Reproducción, Departamentos de 2Ciencias Preclínicas, 3Medicina
Interna, 4Ciencias Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.
5Departamento de Dermatología y Andrología, Universidad de Giessen, Alemania.
aTecnólogo Médico
bBioquímico

Entre 4 y 10% de los casos de esterilidad masculina se atribuyen a inflamación del tracto genital1. La inflamación produce infiltración del líquido seminal con leucocitos, los que alteran la función espermática, disminuyendo la motilidad, desencadenando prematuramente la reacción de acrosoma y disminuyendo la capacidad de fusión al ovocito2-4. Asimismo, la contaminación leucocitaria es nociva para las poblaciones espermáticas desprovistas del plasma seminal, debido a la producción de radicales libres de oxígeno5. Es así como la eliminación de los leucocitos contaminantes, luego del proceso de selección de espermatozoides para técnicas de fecundación asistida, se asocia a un incremento significativo de la capacidad del espermatozoide para fecundar al ovocito6. Los leucocitos que infiltran el líquido seminal provienen en 50 a 60% de la próstata y de las vesículas seminales7. Es por ello que las infecciones de estas glándulas accesorias se traducen en un aumento de leucocitos inflamatorios en el eyaculado. Una de las mayores dificultades para el diagnóstico de procesos inflamatorios del tracto genital masculino reside en la falta de síntomas, por lo que es imprescindible una adecuada detección y clasificación de los leucocitos presentes en el líquido seminal. La detección de leucocitos en el semen mediante la tinción de peroxidasa ha sido recomendada como un indicador adecuado de infección del tracto genital8, encontrándose una correlación positiva entre el número de células peroxidasas positivas y los niveles de elastasa, proteasa liberada por los granulocitos inflamatorios9.

Recientemente, al comparar la tinción de peroxidasa con la detección del marcador de granulocitos CD15, mediante anticuerpos específicos, se ha demostrado que los granulocitos polimorfonucleares (CD15+) en el líquido seminal, no siempre presentan una tinción de peroxidasa positiva10. Esto pone en duda la eficacia de la tinción de peroxidasa para evaluar infección genital asintomática. En este trabajo se seleccionaron pacientes con un alto número de células redondas en el espermiograma (>106 ml-1) y se analizó la correlación existente entre el número de células peroxidasas positivas y la concentración de elastasa del plasma seminal.

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras de líquido seminal. Se seleccionaron 64 pacientes que consultaron al Policlínico de Dermatología y Andrología de la Universidad de Giessen, Alemania y que en el espermiograma presentaron un número igual o mayor a 106 células redondas ml-1. A cada muestra de líquido seminal se realizó tinción de peroxidasa y determinación de concentración de elastasa.

Tinción de peroxidasa. Se utilizó el método descrito por Politch y col11. Brevemente, a 4 ml de una solución de benzidina (0,0125% p/v de benzidina, Sigma Chem Co, St Louis, MO, USA, en 50% etanol), se le adicionó 0,0375% de H2O2. Veinte microlitros de eyaculado se mezclaron con 20 µl de la solución recién preparada de benzidina-H2O2. Después de 5 min de incubación, se adicionó 160 µl de PBS. El recuento de células peroxidasas-positivas (teñidas de color café), se realizó en hemocitómetro usando un microscopio de contraste de fase. El número de células peroxidasas positivas fue expresado en ml-1 de eyaculado12.

Medición de elastasa de granulocitos. El plasma seminal fue obtenido por centrifugación del líquido seminal a 300 xg por 10 min. La concentración de elastasa de granulocitos liberada al plasma seminal y unida al inhibidor de a1-proteasa13, fue determinada por un método de ELISA comercial (Milenia Biotec, Bad Nauheim, Alemania).

Estadística. El análisis estadístico de los resultados se realizó primeramente mediante análisis de correlación de datos de Pearson para muestras de distribución normal, según lo recomendado por el fabricante del kit de elastasa. A los mismos datos se aplicó el análisis no paramétrico de Spearman, debido a que ha sido utilizado en otros estudios de análisis de correlación de elastasa de granulocitos9,12. En ambos casos se consideró valores de p <0,05 significativos.

RESULTADOS

En el líquido seminal de los 64 pacientes estudiados, el promedio y error estándar de la medida (ESM) de los tres parámetros evaluados fue: células redondas 4,32x106 ml-1±0,54 ESM (rango: 0,8-32,5x106 ml-1), células peroxidasa positivas 0,57x106 ml-1±0,14 ESM (rango: 0,01-7,3x106 ml-1) y niveles de granulocito elastasa 314,3 ng/ml ± 59,6 ESM (rango: 10-2000 ng/ml).

La Figura 1 muestra el gráfico de correlación entre el número de células redondas presentes en el eyaculado y los valores de elastasa de granulocitos del plasma seminal. Al aplicar la prueba de Pearson se encontró que no existe una correlación significativa entre ambos parámetros (prueba de Pearson, r=0,03934; p >0,05). Sin embargo, al aplicar la prueba de Spearman, se obtiene una correlación positiva entre el número de células redondas y los niveles de granulocito elastasa (r=0,4890; p <0,0001).

Figura 1. Correlación entre los niveles de granulocito-elastasa y células redondas en el líquido seminal.

El gráfico de correlación entre el número de células peroxidasa positivas y los niveles de elastasa de granulocitos se muestra en la Figura 2. De acuerdo a la prueba de Pearson, la correlación no fue significativa (r=0,2237; p >0,05), pero nuevamente, al aplicar la prueba de Spearman, se obtuvo una correlación positiva entre los niveles de granulocito elastasa y el número de células peroxidasas positivas presentes en el eyaculado (r=0,5723; p <0,0001).

Figura 2. Correlación entre los niveles de granulocito-elastasa y células peroxidasas positivas en el líquido seminal.

DISCUSIÓN

Parte importante de las infecciones del tracto genital masculino son asintomáticas, por lo que para prevenir la esterilidad y realizar una adecuada terapia en el varón, es fundamental disponer de exámenes de laboratorio que contribuyan a su diagnóstico14. Entre los exámenes disponibles, la evaluación del número de leucocitos en el plasma seminal es uno de los elementos importantes para el diagnóstico de la infección genital asintomática o silente15.

Existen varios métodos para determinar la presencia de leucocitos, siendo una de las más utilizadas, por la fácil realización y bajo costo, la tinción de peroxidasa, basada en la capacidad de la enzima para catalizar la reacción de oxidación de la benzidina por el peróxido de hidrógeno12. La tinción de peroxidasa es dependiente de la cantidad de peroxidasa presente en el granulocito. En el granulocito, la mieloperoxidasa está contenida en los gránulos azurófilos, los que también contienen a la elastasa. Los granulocitos presentes en el foco inflamatorio vacían el contenido de sus gránulos, liberando, entre otras, tanto la elastasa como la peroxidasa. Esto se traduce en una mayor concentración de elastasa extracelular, por lo que la concentración de elastasa en el plasma seminal es útil como parámetro indicador de inflamación, y simultáneamente en una célula carente de peroxidasa. Por lo tanto, es muy probable que las dos determinaciones, de elastasa y peroxidasa, no se correlacionen en procesos inflamatorios, tal como lo muestran nuestros resultados. Es posible que en estados de leucocitoespermia no asociada a procesos inflamatorios activos, la determinación de células peroxidasa positivas realmente refleje el número de leucocitos.

En este trabajo además se demuestra la importancia de aplicar la prueba estadística correcta. Como es conocido, las células redondas no tienen mayor significado en el diagnóstico de la infección seminal, ya que mayoritariamente corresponden a células de la línea germinal10. Sin embargo, cuando aplicamos la prueba estadística no paramétrica (prueba de Spearman), en variables con una distribución normal o cercana a lo normal, permitió obtener una correlación positiva entre los valores de elastasa de granulocitos tanto con el número de células redondas como con el número de células peroxidasas positivas presentes en el eyaculado.

Como conclusión se puede afirmar que para el diagnóstico de un proceso inflamatorio activo asintomático en el tracto genital masculino, es de elección la determinación de elastasa en el plasma seminal16, como también la detección de granulocitos polimorfonucleares neutrófilos, ya sea por inmunofluorescencia10 o citometría de flujo17.

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Correspondencia a: Dr. Raúl Sánchez G. Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Francisco Salazar 01145, Temuco, Chile. Fax: 45/325600. E mail: rsanchez@ufro.cl