SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.67 número1CONIZACION POR ASA: EXPERIENCIA EN HOSPITAL CARLOS VAN BURENESTUDIO DESCRIPTIVO DE LOS ASPECTOS EMOCIONALES ASOCIADOS A LA INFERTILIDAD Y SU TRATAMIENTO índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Revista chilena de obstetricia y ginecología

versión On-line ISSN 0717-7526

Rev. chil. obstet. ginecol. v.67 n.1 Santiago  2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-75262002000100003 

Trabajos Originales

PARTO PREMATURO ASOCIADO A COLESTASIA
INTRAHEPATICA DEL EMBARAZO. ROL DEL
ACIDOCOLICO EN LA MODULACION DE LA VIA
OCITOCINA-RECEPTOR DE OT EN EL MIOMETRIO*

Drs. Alfredo M. Germain A.1, Sumie Kato1, Gloria Valdés2, Jorge Carvajal1 y Juan Carlos Glasinovic3

1Departamento de Obstetricia y Ginecología. 2Nefrología, 3Gastroenterología y Centro de Investigaciones Médicas, Pontificia Universidad Católica de Chile


RESUMEN

Se ha reportado una asociación entre CIE y distrés fetal, muerte fetal in utero y síntomas de parto prematuro/parto prematuro. Con la hipótesis que en la CIE el aumento en los ácidos biliares, en particular ácido cólico, activa la vía ocitocina-receptor de ocitocina (OT-ROT) en el miometrio, generando un inicio prematuro del trabajo de parto, evaluamos la sensibilidad miometrial a OT in vitro e in vivo, y la expresión de mRNA en pacientes CIE y controles y la capacidad de ácido cólico para regular la activación de la vía OT-ROT.
Las pacientes con CIE mostraron una alta sensibilidad a OT in vivo e in vitro comparado con controles. Al incubar segmentos/células en cultivo de miometrio con ácido se observó una marcado aumento de la sensibilidad contráctil para la OT y un aumento de la expresión celular del mRNA y los niveles de la proteína del ROT. La activación de la vía OT-ROT parece ser el resultado de un aumento de la síntesis/función de RsOT mediada por el ácido cólico. Esto resultados entregan las bases celulares/moleculares que podrían explicar la asociación entre CIE y parto prematuro.

PALABRAS CLAVES: Colestasia gravídica, parto prematuro, sufrimiento fetal

SUMMARY

Intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with preterm labor and delivery. We hypothesize that in the course of this disease, bile acids activate the oxytocin receptor pathway leading to the premature onset of labor.
We evaluated in vitro and in vivo myometrial sensitivity to oxytocin and the oxytocin-receptor expression in patients with cholestasis and control. Furthermore, we evaluated the ability of cholic acid to mediate the activation of the oxytocin-receptor pathway.
Patients with cholestasis of pregnancy, compared to controls, required lower doses of oxytocin to elicit 3 uterine contractions in 10 minutes (1.3 ± 0.6 vs 3.6 ± 0.8 Units; p < 0.05) and had lower in vitro ED50 (1.6 x 10_10 M vs 1.0 x 10_8 M; p < 0.05), reflecting higher oxytocin sensitivity. The long-term (24 h) incubation of myometrial strips from control patients with cholic acid (20 µM) markedly increased the sensitivity to oxytocin, but not to endothelin-1 or prostaglandin F2a. The 24 h incubation of cultured myometrial cells with cholic acid increased the expression of oxytocin-receptor at mRNA (northern blot) and protein levels (western blot and immunohistochemistry).
Our results demonstrate that in the setting of intrahepatic cholestasis of pregnancy, an activation of the oxytocin-receptor pathway occurs. The activation of such pathways seems to be the result of a cholic acid mediated increase in receptor expression, which in turn could explain the increase in the preterm labor and delivery rate observed in this disease.

KEY WORDS: Intrahepatic cholestasis, preterm labor - fetal distress

INTRODUCCION

La colestasia intrahepática del embarazo (CIE) es un desorden hepático específico de la especie humana. Ocurre al final de la gestación y está caracterizado por colestasia bioquímica y prurito con ausencia de lesiones cutáneas. Esta enfermedad en general no produce morbilidad o mortalidad materna, pero se ha documentado una asociación entre CIE y distress fetal, muerte fetal in utero y síntomas de parto prematuro/parto prematuro (1, 2, 3). El riesgo de parto prematuro en pacientes con CIE estudios con CIE en un estudio descriptivo y no controlado alcanza valores hasta 44% (3). Nuestros datos retrospectivos, caso-control, con un mayor número de pacientes indican un aumento de 4 veces en el riesgo de parto prematuro espontáneo (razón de Odds (IC 95%) 3,98 (1,96 - 8,22, p < 0,05) (4). Este elevado riesgo de síntomas de parto prematuro/parto prematuro en pacientes con CIE está asociado con el inicio temprano de la enfermedad y el grado de disfunción hepática, lo que sugiere que una CIE más severa aumenta el riesgo de prematurez (5).

Los mecanismos celulares/moleculares responsables de parto prematuro asociado a CIE no han sido establecidos. Por mucho tiempo se ha relacionado los niveles de ácidos biliares en el plasma materno con la severidad tanto de la colestasia materna como a las complicaciones fetales (por ej. distress fetal) (6). Es interesante considerar que cerca de 2/3 de las pacientes con ICP tienen elevados niveles de ácidos biliares en ayunas o postpandriales, siendo el principal de ellos el ácido cólico (7, 8). En oveja preñada, la administración intravenosa materna (aguda) (9) o fetal (crónica) (10) de ácidos biliares gatilla la generación de contracciones uterinas y parto prematuro en 20 y 100% de los animales respectivamente. Se ha reportado también un aumento dosis-dependiente de ácido cólico de la respuesta contráctil en segmento miometriales de rata no preñada (11). Hace más de una década, un grupo de investigadores utilizando segmentos de miometrio in vitro obtenidos de pacientes con CIE y controles, demostraron que el miometrio de pacientes con CIE genera una exagerada respuesta contráctil a dosis farmacológicas de OT (10_2 a 10_4 M) (12).

Postulamos que en esta condición el parto prematuro es el resultado de una activación prematura de la vía OT-ROT a través de un mecanismo que involucra ácidos biliares.

Para comprobar esta hipótesis evaluamos en pacientes y tejidos obtenidos de pacientes con CIE y controles: a) la actividad uterina basal y la respuesta a OT in vitro e in vivo, b) el contenido decidual de OT y los niveles de mRNA de ROT. En tejido miometrial y células miometriales en cultivo obtenidos de pacientes controles investigamos el rol del ácido cólico sobre la sensibilidad miometrial a OT y sobre la expresión del ROT.

Nuestros datos indican que, en la CIE existe una activación prematura de la vía OT-ROT en el miometrio, a través de un mecanismo que involucra al ácido cólico. Esto nos proporciona una explicación tentativa para la relación entre CIE y trabajo parto prematuro/parto prematuro.

MATERIAL Y METODO

Este estudio se realizó en la Escuela de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile. El protocolo de estudio fue aprobada por el Comité de ética de nuestra institución. Las pacientes participaron en los protocolos bajo consentimiento informado.

Pacientes. El criterio diagnóstico para CIE (4) fue el siguiente: prurito continuo y generalizado preferentemente nocturno, localizado principalmente en las palmas y plantas de los pies, el cual desaparece al comienzo del puerperio, b) ausencia de evidencia clínica y ultrasonografía de enfermedad obstructiva de la vía biliar), c) ausencia de evidencia clínica de hepatitis viral, d) ausencia de fiebre o malestar general, e) ausencia de patología dermatológica o médica que podría producir prurito. Además, como criterio de diagnóstico se consideró un aumento de los ácidos biliares plasmáticos > 10 µM (7).

El manejo clínico de las pacientes se mantuvo constante a través del protocolo siguiendo las normas de nuestra institución (4).

Reactivos. Los reactivos usados son SIGMA, a menos que sea especificado.

Evolución longitudinal de la frecuencia de contracciones uterinas (promedio 24 horas). Evaluamos el promedio de la frecuencia de contracciones uterinas (cu) en 24 horas, cuantificada y calculada como se ha descrito previamente por nosotros (13). Brevemente, las pacientes se hospitalizaron a intervalos de 2 semanas desde las 28 semanas de gestación hasta el parto. Se adaptó un tocodinamómetro externo a la pared abdominal 4 cm bajo el fondo uterino.

Se definieron las contracciones uterinas como elevaciones desde la línea base, mayores de 30 seg de duración. Se excluyeron las contracciones de baja amplitud y alta frecuencia (ondas de Alvarez). Se incluyó un grupo control compuesto por 13 pacientes con embarazo normal pareadas por edad y paridad. Se empleó el mismo criterio de inclusión previamente reportado por nosotros (13).

Test de sensibilidad a OT in vivo. Se realizó en 7 pacientes con CIE y controles que cursaban su primer embarazo, pareadas por edad gestacional y condiciones cervicales (puntaje de bishop). A las 38 semanas de gestación las pacientes fueron estudiadas en decúbito en la unidad de preparto. Se monitorizó la frecuencia cardíaca y las contracciones uterinas con transductores externos. Se registraron las contracciones uterinas basales por 30 minutos y luego se administró OT en forma intravenosa a través de una bomba de infusión continua. La velocidad de infusión comenzó con 1 mU/minuto aumentando progresivamente al doble cada 30 minutos hasta alcanzar una frecuencia de 4 contracciones uterinas en un intervalo de 10 minutos. Se analizó la dosis mínima efectiva de OT (DME) para alcanzar una frecuencia de 4 cu/10 minutos. En el grupo control de 7 pacientes que cursaron un embarazo normal, la administración de OT se mantuvo hasta completar el objetivo. Después de realizar este test, una paciente continuó con contracciones uterinas y comenzó su trabajo de parto. Las 6 pacientes restantes se derivaron a sus hogares después de 12 horas de observación. Todas las pacientes tuvieron partos normales de término, con recién nacidos sanos.

Evaluación de contractilidad miometrial in vitro. Se tomaron muestras de miometrio de pacientes con cesárea electiva por indicaciones obstétricas (por ej., podálica). Se extrajo una pequeña biopsia de miometrio desde el labio superior de la histerotomía. Se cortaron segmentos longitudinales de músculo liso miometrial (6,0 x 1,5 mm) y se montaron para la mediación de fuerza isométrica en baños termorregulados (Radnotti, California USA), en solución salina fisiológica (NaCl (120,5 mM), KCl (4,8 mM), MgSO4 (1,2 mM), NaH2PO4 (1,2 mM), NaHCO3 (20,4 mM), CaCl2 (1,6 mM), glucosa (10 mM) y piruvato (1 mM), pH 7,4) a 37° C. Los segmentos de miometrio se estiraron a Lo (Longitudinal óptima para desarrollo máximo de la fuerza) aplicando 12 gramos de fuerza y condicionándolos por una contracción en solución salina fisiológica con KCl (60 mM) sustituida isotónicamente por NaCl. Las drogas se diluyeron en solución salina fisiológica. La respuesta contráctil fue cuantificada como el área de fuerza activa bajo la curva de contracción y su resultado se expresó como en función del área de sección transversal según la siguiente fórmula: P/LxD donde P es el peso húmedo del tejido en gramos, L es la longitud del segmento estirado en cm y D es la densidad del tejido (1,05 g/cm3) (14).

Esta preparación se utilizó para realizar los experimentos de curva dosis respuesta acumulativa para OT (10_12 a 10_7 M) con segmentos de miometrio de pacientes CIE y controles a las 38 semanas de gestación. Para analizar el efecto agudo/subagudo (0/24 horas) de incubación con ácido cólico (sal sódica, 20 µM) a la respuesta miometrial de OCT (10_12 a 10_7 M), endotelina_1 (10_12 a 10_7 M) y prostaglandina F2a (10_12 a 10_7 M) se utilizaron muestras obtenidas de pacientes normales al término de la gestación.

Células miometriales en cultivo. Se aislaron células musculares lisas miometriales desde tejido miometrial de pacientes embarazadas normales. Brevemente, el tejido miometrial se trituró e incubó en baño termorregulado con agitación por 4 horas a 37° C con medio de digestión (colagenasa (1,5 mg/ml; ~150 U/mg), deoxirribonucleasa I (0,1 ng/ml; ~2000 U/mg), y solución antibiótico-antimicótico (2%, v/v). Las células dispersas se separaron del tejido no digerido por filtración a través de una gasa y fueron peleteadas centrifugando el filtrado a 400 g por 10 min, luego se resuspenden en medio Ham's F-12: Dulbeccó Modified Eagle's (F12:DMEM, 1:1, v/v) con suero bovino fetal (SBF; 10%, v:v), penicilina G (100 U/ml) y estreptomicina sulfato (100 µg/ml). Se sembraron en placas plásticas tratadas para cultivo (100 mm de diámetro) y se mantuvieron en atmósfera húmeda de aire y CO2 (5%) hasta que alcanzaron la confluencia aproximadamente 7 a 10 días después de sembradas (15). El medio de cultivo se cambió cada 48 horas. Una vez alcanzada la confluencia, las células fueron mantenidas en medio de cultivo sin SBF por 24 horas, para luego reemplazar nuevamente a medio sin SBF conteniendo los agentes a estudiar.

Western blot para receptor de OT. Células miometriales en cultivo se lavaron con PBS y se peletearon con una solución de fenilmetilsulfonilfluorido, luego se centrifugaron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a _80° C. El pellet se resuspendió en buffer de suspensión (0,1 M NaCl, 0,01 M Tris Cl pH 7,6, 0,001 M EDTA pH 8, 1 µg/ml Aprotinina, 100 µg/ml PMSF).

Las células se lisaron por sonicación y se centrifugaron a 1000 g por 5 min. El pellet se resuspendió en buffer de suspensión y se determinó la concentración de proteína por Bradford (16). La proteínas (10 µg/línea) se separaron por SDS-PAGE en minigel al 8% y fueron electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa (1 h a 100 v). Las membranas se bloquearon toda la noche en PBS con leche descremada al 5%, luego 3 lavados 10 min cada uno con PBS - tween 20 al 0,05%. Se incubó con primer anticuerpo anti-ROT (O-2F8) previamente caracterizado (17) (ROHTO Pharmaceuticals CO, LTD, Osaka, Japan) a una concentración final de 1,4 µg/ml. Luego las membranas se lavaron con PBS - tween 20 al 0,05% e incubadas con segundo anticuerpo antiratón unido a peroxidasa (1:2000). Las membranas fueron nuevamente lavadas y las bandas inmunoreactivas se visualizaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia (Amersham ECL).

Inmunohistoquímica para el receptor de OT. Las coverslips con células miometriales se fijaron en acetona fría (_20° C) por 10 min. Luego se lavaron 3 veces por 5 min con butter (PBS) y se incubaron con primer anticuerpo anti-ROT (O-2F8) (1:100) por 18 horas, seguido de 3 lavados con PBS. Posteriormente las muestras se incubaron con IgG Conejo anti Ratón Dako Z0456 (1:56) por 30 min. Finalmente las muestras se lavaron e incubaron con Pap Conejo Dako Z0113 (1:100) por 30 min. La cuantificación de la intensidad de la señal del ROT fue evaluada en 4 campos opuestos de células confluentes en una magnificación de 400 x. Cada campo fue graduado de 0 a 3 de acuerdo con la intensidad de la señal para el ROT; siendo = 0 sin señal, 1= algunas células con señal; 2= moderada cantidad de células con señal y 3= la mayor parte de las células con señal. El puntaje final correspondió a la suma de los puntajes obtenidos para cada campo. El puntaje fue entregado por dos observadores independientes, en forma ciega al grupo experimental. La correlación de los puntajes entre los observadores fue de 0,89.

Northern Blot para receptor de OT. El tejido se pulverizó en nitrógeno líquido usando mortero en frío. Luego el tejido en polvo se homogenizó en solución de Chomczynski con fenol agregando posteriormente cloroformo a la mezcla. Después de una centrifugación a 1.200 x g por 15 min a 4° C, se extrajo la fase acuosa superior y el RNA se precipitó usando alcohol isopropílico. El RNA total (5-20 µg por línea) se fracciona por electroforesis en gel de agarosa-formaldehído al 1% y electrotransferido a membranas de nylon (Hybond-N+; Amersham, Arlington Heights, IL). El RNA fue fijado a la membrana por UV cross-linker. La prehibridización se realiza a 65° C por 2 horas en solución de SDS (7%) p/v) tampón fosfato (0,5 M), EDTA pH 7,8 (1mM) y BSA (0,7% p/v) (18). La hibridización fue realizada a 65° C durante toda la noche en la solución descrita anteriormente agregando la sonda cDNA específica. Para evaluar el mRNA del ROT, se utilizó un fragmento de 0,81 kb del gen de receptor de OT humano (19), el cual fue sintetizado utilizando hexanucleótidos marcados con dCTP (a_32P). Después de la hibridización las membranas se lavaron dos veces con 0,2 x SCC y SDS (0,1% p/v) por 15 minutos a 65° C, y dos veces con 0,1 x SCC y SDS (0,1% p/v) por 20 minutos a 65° C. La cantidad de RNA total por línea fue evaluada por visualización de las subunidades ribosomales 28S y 18S. Finalmente, se realizó una autorradiografía de las membranas a _80° C usando films Kodak X Omat AR y los estudios fueron analizados por análisis densitométrico del transcrito específico del ROT y de la subunidad 18S utilizando un densitómetro acoplado a un software (Scientific Image System. Kodak 1D 2.0).

RESULTADOS

Evaluación longitudinal de la frecuencia de contricciones uterinas (promedio de 24 horas). Las características generales de las pacientes son descritas en la Tabla 1. Más de un tercio (5/14) de las pacientes con CIE presentaron síntomas/trabajo de parto prematuro. No se encontraron diferencias significativas en la frecuencia de contracciones uterinas espontáneas a lo largo de la gestación entre pacientes controles o CIE que tuvieron tanto un parto prematuro o a término.

Test de sensibilidad a OT in vivo. Las pacientes con CIE pareadas por puntaje de bishop (4,8 ± 1,0 y 4,6 ± 0,7 respectivamente; n.s.) y edad gestacional (38 ± 0,2 y 38,2 ± 0,1 respectivamente; n.s.) con pacientes controles requirieron una dosis efectiva de OT significativamente más baja para generar una frecuencia de 4 cu/10 minutos (1,3 ± 0,6 vs 3,6 + 0,8 Unidades de OT; p < 0,03) (Figura 1).

Tabla I

CARACTERISTICAS GENERALES PACIENTES DEL ESTUDIO LONGITUDINAL DE FRECUENCIA DE CONTRACCIONES UTERINAS PROMEDIO 24 HORAS

Grupo

n

Paridad

Edad materna

Edad gestacional

Edad gestacional

Peso del recién

   

Primigesta

Multíparas

(años

al ingreso (sem)

al parto (sem)

 

nacido (g)

Control

13

2

11

27,2 ± 0,9

26,4 ± 0,4

39,2 ± 0,4

3378 ± 155

CIE

14

6

  8

29,3 ± 1,4

28,9 ± 0,5

37,1 ± 0,3

3098 ± 133

Valores se expresan como promedio + ES.

Curva dosis respuesta a OT in vitro. Se observó una mayor respuesta contráctil miometrial tanto en condiciones basales, como en la curva dosis respuesta a OT en pacientes con CIE (n= 7) comparado con pacientes controles (n= 7) (p < 0,05; Figura 2). La dosis efectiva 50 (D50) para CIE fue 1,6 x 10_10 M y 1,0 x 10_8 M en los controles respectivamente.

Efecto de ácido cólico en la respuesta miometrial a OT in vitro. La incubación por 24 horas de segmentos de miometrio con ácido cólico (20 µM) seguido por una curva dosis respuesta acumulativa a OT mostró un aumento de la respuesta a OT al comparar con segmentos incubados con solución salina fisiológica (n= 6; p < 0,05; Figura 3). Este efecto no se observó en la respuesta miometrial a endotelina-1 o prostaglandina F2a (datos no mostrados).

Efecto de la incubación de ácido cólico sobre los niveles de mRNA de receptor de OT. Se observó un aumento dosis respuesta en los niveles de mRNA de ROT al incubar células miometriales en cultivo con ácido cólico una forma dosis-respuesta (0 a 1.000 µM; n= 5; p < 0,05) (Figura 4). Al incubar diferentes tiempos (0, 6, 12, 24 y 48 horas) se determinó que el efecto de ácido cólico comenzó a las 6 horas de tratamiento, pero su máximo efecto se alcanzó a las 24 horas de incubación (datos no mostrados).

En otras series de experimentos se demostró que colesterol (n= 3; rango de dosis 2 a 1000 µM) o ácido deoxicólico (n= 3, rango de dosis 0,2 a 200 µM) no producen cambios en los niveles de mRNA de ROT.

Efectos de ácido cólico en la expresión de proteína del receptor de OT. Se incubaron células miometriales en cultivo con ácido cólico (20 µM) observándose un aumento de la expresión de niveles de proteína de ROT, como se evidencia tanto por el western blot (n= 5; p < 0,05) como por la inmunohistoquímica (n= 5; p < 0,05) (Figuras 5 y 6) respectivamente.

Figura 1. Respuesta contráctil miometrial a ocitocina in vivo evaluada como la mínima dosis efectiva de ocitocina necesaria para generar 4 contracciones uterinas en un período de 10 min en pacientes controles (n= 7) y CIE (n= 7). Datos presentados como promedio + ES, *p < 0,03.

Figura 2. Curva dosis-respuesta a ocitocina in vitro en segmentos de miometrio de pacientes controles (n= 7; o) y CIE (n= 7; •). Datos presentados como Promedio + ES; p < 0,05.

Figura 3. Curva dosis-respuesta a ocitocina en presencia de ácido cólico (20 µM). Segmentos de miometrio obtenidos de pacientes normales con parto a término se preincubaron con solución Krebs (n= 6; o) o ácido cólico (n= 6; •) por 24 horas. Datos presentados como Promedio ± ES; p < 0,05.

Figura 4. Niveles de expresión de mRNA del receptor de ocitocina (ROT) en células de miometrio en cultivo sometidas a una curva dosis-respuesta a ácido cólico, n= 5; p < 0,05. En la parte inferior se observa el promedio ± ES de los 5 experimentos.

Figura 5. Western blot de receptor de ocitocina en explantes de miometrio preincubados 24 horas con ácido cólico (20 µM).

Figura 6. Inmunohitoquímica para receptor de ocitocina en células miometriales en cultivo. A: control; B: 2 µM ácido cólico; C: 20 µM ácido cólico; D: 200 µM ácido cólico; E: control positivo (tejido miometrial término del embarazo); F: control negativo (tejido miometrial sin primer anticuerpo).

DISCUSION

En este estudio, se demuestra un aumento de la sensibilidad a OT tanto in vivo como in vitro en pacientes y tejido miometrial obtenidos de pacientes CIE comparado con controles. Además, nuestros resultados indican que el ácido cólico actúa sobre el miometrio aumentando la sensibilidad de OT vía un aumento de la expresión génica del ROT. La información que existe acerca del control del parto en humanos aún es insuficiente. En partos de término y pretérmino, la transición del miometrio desde su estado quiescente a un estado activo durante la gestación involucra muchos mediadores maternos y fetales. Existen muchas uterotoninas que son importantes en el proceso de trabajo de parto. Una de ellas es OT, la cual ha sido usada clínicamente por muchos años para aumentar las contracciones uterinas. La OT es producida en muchos tejidos, incluyendo el amnion, corion, decidua y placenta (19). La producción de OT por la decidua-corion aumenta 3 a 4 veces al comienzo del trabajo de parto (revisado en 20). Los receptores de OT se han encontrado en la decidua-corion y miometrio, entre otros tejidos (17, 19, revisado en 20). La concentración de ROT en el miometrio aumenta sobre 12 veces desde las 37 a las 41 semanas de gestación (20).

Estos hallazgos, junto con la efectividad del bloqueador de ROT, Atosiban, recientemente reportado para tratar el trabajo de parto prematuro (20, apoyan la importancia de OT en el inicio del trabajo de parto prematuro/término en la especie humana.

Postulamos que en pacientes con CIE la vía OT-ROT está activada en forma prematura. En aquellos pacientes en que esta activación sobrepase los mecanismos de quescencia uterina normal presentarán un parto prematuro. Hemos demostrado que existe una mayor sensibilidad miometrial a OT en pacientes a término con CIE usando estudios in vivo e in vitro. Además, en una población seleccionada de pacientes con CIE se confirma la asociación entre CIE y trabajo de parto prematuro.

La evaluación de la actividad uterina espontánea no evidencia diferencia entre pacientes controles o CIE (parto a término o prematuro) varios días antes del inicio espontáneo del parto. Los niveles similares de mRNA de ROT observados en tejidos obtenidos desde pacientes CIE comparados con controles, (a pesar de una mayor respuesta contráctil a OT) puede reflejar la amplia variación en la expresión génica que también se observa respecto a la intensidad de la CIE clínica y a las fluctuantes concentraciones de ácidos biliares plasmáticos observados en esta condición (7, 8, 21). Desafortunadamente no contamos con los niveles de ácidos biliares plasmáticos al momento de tomar la muestra para evaluar la expresión génica. No se excluye la regulación del ROT a niveles que no sea la expresión de genes (por ej. cambio directo en la afinidad a ROT) pero parece poco probable ya que en células miometriales el ácido cólico ejerce su efecto a nivel de expresión de genes como se evidencia desde los niveles de proteína y mRNA del ROT.

Además en otros modelos, la desensibilización de los RsOT también está acoplada a una reducción en los niveles de mRNA (22) lo que apoya que cambios en la expresión génica modifican su actividad biológica.

Cuando evaluamos el rol del ácido cólico en segmentos de miometrio de pacientes normales a concentraciones similares a las observadas en pacientes con CIE, observamos que al incubar por largo plazo (pero no corto plazo o en forma aguda) estos segmentos desarrollan un fenotipo contráctil (es decir una alta sensibilidad a OT) similar a los observados en pacientes con CIE. Estos efectos parecen ser específicos, ya que no se observó un aumento de la sensibilidad miometrial a endotelina-1 o prostaglandina F2a o al cambiar ácido cólico por ácido deoxicólico o colesterol. Además, el tratamiento de células miometriales con ácido cólico genera un claro aumento dosis-respuesta en la expresión del receptor de OT tanto de mRNA como niveles de proteína. Estos datos apoyan un rol de ácido cólico como potencial mediador del trabajo de parto prematuro en pacientes con CIE a través de una activación prematura de la vía OT-ROT.

La severidad materna de la CIE puede ser determinada por los niveles de ácidos biliares plasmáticos y la función hepática. Las pacientes con CIE a menudo presentan niveles de ácidos biliares en el suero entre 10 a 100 veces mayores a los observados en estado no grávido (1).

Además, reportamos que en la generación de la CIE, la frecuencia de síntomas de parto prematuro/parto prematuro está fuertemente relacionado con la severidad de los marcadores de la enfermedad como presentación temprana, aparición de ictericia y meconio en líquido amniótico (5). Recientemente, se ha relacionado a los ácidos biliares con la ocurrencia de muerte fetal, observada en esta condición. En cardiomiocito de rata recién nacida se demostró que ácido cólico (Taurocolato de sodio) en dosis de 0,3 y 3 mM alteraron la velocidad y el ritmo de los cardiomiocitos y causaron una dinámica anormal de Ca+2, sugiriendo que en el corazón del feto los ácidos biliares pueden ser potenciales mediadores responsables de la muerte súbita fetal observadas en esta condición (23).

¿Cuál es el mecanismo por el cual los ácidos biliares aumentan la expresión de los OTR? En los últimos años se han caracterizado tres zonas de unión proteína-DNA ubicados en la región 5' del gen del receptor de OT humano, una inhibitoria y dos estimulatorias ("uterine stimulation") US-1 y US-2 (24). Con respecto al US-1, el peso del complejo principal proteína-DNA es cercano a los 70 kDa y la proteína está aún en proceso de identificación. El US-2 abarca las bases -1433 a la -1414 en el gen del receptor de OT. La proteína de unión pesa 18 kDa y su secuencia de DNA presenta un alto grado de homología con un factor de transcripción llamado MafF, presente en pollo y murinos (25). Esta proteína incrementa sus niveles en miometrio de término presenta una actividad de unión específica en la zona del promotor. Nuestros resultados preliminares (datos no publicados), usando células miometriales en cultivo, indican que además de un incremento del mRNA del ROT el ácido cólico también inducen un incremento dosis-dependiente de los niveles de mRNA de MafF. Esto sugiere que el ácido cólico puede promover en el miometrio la activación de las vías OT-ROT incrementando la transcripción del gen a nivel de la región US-2. Especulamos que en pacientes con CIE la ocurrencia de parto prematuro es una respuesta adaptativa materna a la falla hepática en un intento de salvaguardar la vida fetal.

AGRADECIMIENTOS: A todo el personal médico y paramédico de la maternidad del hospital clínico de la Pontificia Universidad Católica por su colaboración en la recolección de los tejidos.

A Cecilia Chacón y Rossana Vidal por su experta asistencia técnica.

A Rodolfo Wild y Gustavo Gormáz por su constante apoyo y estímulo durante todo el proyecto.

BIBLIOGRAFIA

1. Germain AM, Carvajal JA, Glasinovic JC, Kato S, Williamson C: Intrahepatic cholestasis of pregnancy. An intriguing pregnancy specific disorder. Soc Gynecol Invest 2001 (en prensa).         [ Links ]

2. Johnston WG, Baskett TF: Obstetric cholestasis. A 14 year review. Am J Obstet Gynecol 1979; 133(3): 299-301.         [ Links ]

3. Fisk NM, Storey GN: Fetal outcome in obstetric cholestasis. Br J Obstet Gynaecol 1988; 95(11): 1137-43.         [ Links ]

4. Rioseco AJ, Ivankovic MB, Manzur A, Hamed F, Kato SR, Parer JT, Germain AM: Intrahepatic cholestasis of pregnancy: a retrospective case-control study of perinatal outcome. Am J Obstet Gynecol 1994; 170(3): 890-5.         [ Links ]

5. Sánchez A, Carvajal J, Nien J, Germain AM: Intrahepatic cholestasis of pregnancy. A role of liver cholestasis on the premature onset of labor. J Soc Gynecol Invest 1999; 6: 205A (Abstr 622).         [ Links ]

6. Laatikainen T, Tulenheimo A: Maternal serum bile acid levels and fetal distress incholestasis of pregnancy. Int J Gynaecol Obstet 1984; 22: 91-94.         [ Links ]

7. Glasinovic JC, Marinovic I, López J, Vela P, Ahumada E, Valdivia MT, Gómez X: Colestasia gravídica: Varia

bilidad de la intensidad del fenómeno colestásico y su fluctuación temporal. Rev Méd Chile 1983; 111: 778-82.

8. Heikkinen J, Maentausta O, Ylostalo P, Janne O: Changes in serum bile acid concentration during normal pregnancy, in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy and in pregnant women with itching. Br J Obstet Gynaecol 1981; 88(3): 240-5.         [ Links ]

9. Pérez R, García M, Ulloa N, Jara C, Bardisa L, Rudolph MI: A single intravenous high dose of cholic acid to a pregnant ewe does not affect fetal well-being. Berlín: Res Exp Med 1994; 194(1): 63-7.         [ Links ]

10. Campos GA, Guerra FA, Israel EJ: Effects of cholic acid infusion in fetal lambs. Acta Obstet Gynecol Scand 1986; 65(1): 23-6.         [ Links ]

11. Campos GA, Castillo RJ, Toro FG: Effect of bile acids on the myometrial contractility of the isolated pregnant uterus. Rev Chil Ginecol 1988; 53(4): 229-33.         [ Links ]

12. Israel EJ, Guzmán ML, Campos GA: Maximal response to oxytocin of the isolated myometrium from pregnant patients with intrahepatic cholestasis. Acta Obstet Gynecol Scand 1986; 65: 581-2.         [ Links ]

13 Germain AM, Guillermo JV, Ivankovic M, Ducsay CA, Gabella C, Seron-Ferre M: Relationship of circadian rhythms of uterine activity with term and preterm delivery. Am J Obstet Gynecol 1993; 168: 1271-7.         [ Links ]

14. Word RA, Kamm KE, Casey ML: Contractile effects of prostaglandins, oxytocin, and endothelin-1 in human myometrium in vitro: refractoriness of myometrial tissue of pregnant women toprostaglandin E2 and F2 alpha. J Clin Endocrinol Metabol 1992; 75(4): 1027-32.         [ Links ]

15. Casey ML, MacDonald PC, Mitchell MD, Snyder JM: Maintenance and characterization of human myometrial smoot muscle cells in monolayer culture. In vitro 1984; 20(5): 396-403.         [ Links ]

16. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248-54.         [ Links ]

17. Takemura M, Kimura T, Nomura S, Makino Y, Inoue T, Kikuchi T, Kubota Y, Tokugawa Y, Nobunaga T, Kamiura S et al: Expression and localization of human oxytocin receptor mRNA and its protein in chorion and decidua during parturition. J Clin Invest 1994; 93(6): 2319-23.         [ Links ]

18. Germain AM, MacDonald PC, Casey ML: Endothelin receptor mRNAs in human fetal membranes, chorionic vessels, and decidua parietalis. Mol Cell Endocrinol 1997; 132(1-2): 161-8.         [ Links ]

19. Kimura T, Tanizawa O, Mori K, Brownstein MJ, Okayama H: Structure and expression of a human oxytocin receptor. Nature 1992; 356(6369): 526-9.         [ Links ]

20. Mitchell BF, Schmid B: Oxytocin and its receptor in the process of parturition. J Soc Gynecol Invest 2001; 8(3): 122-33.         [ Links ]

21. Reyes H: The enigma of intrahepatic cholestasis of pregnancy: lessons from Chile. Hepatology 1982; 2: 87-96.         [ Links ]

22. Phaneuf S, Asboth G, Carrasco MP, Europe-Finner GN, Saji F, Kimura T, Harris A, López Bernal A: The desensitization of oxytocin receptors in human myometrial cells isacompanied by down-regulation of oxytocin receptor messenger RNA. J Endocrinol 1997; 154(1): 7-18.         [ Links ]

23. Williamson C, Gorelik J, Eaton BM, Lab M, De Swiet M, Korchev Y: The bile acid taurocholate impairs rat cardiomyocyte function: a proposed mechanism for intrauterine fetal death in obstetric cholestasis. Londres: Clin Sci 2001; 100(4): 363-9.         [ Links ]

24. Kimura T, Ivell R: The oxytocin receptor. Results Probl Cell Differ 1999; 26: 135-68.         [ Links ]

25. Kimura T, Ivell R, Rust W, Mizumoto Y, Ogita K, Kusui C, Matsumura Y, Azuma C, Murata Y: Molecular cloning of a human MafF homologue, which specifically binds to the oxytocin receptor gene in term myometrium. Biochem Biophys Res Commun 1999; 264(1): 86-92.         [ Links ]

DISCUSION

Dr. Guzmán: Felicita al autor, destaca su trayectoria de investigación de 15 años. Resalta su nivel que estudia las patologías obstétricas a nivel molecular y comenta sobre la disminución de la severidad de los casos de colestasia que se presentan actualmente en Chile.

Dr. González: Comenta sobre la calidad del trabajo y la importancia de una definición adecuada de la enfermedad. Es más preciso hablar de colestasia cuando existe una alteración de laboratorio que lo demuestre, así se puede estudiar de manera más precisa su relación con resultados perinatales.

Dr. Gormáz: Felicita al autor y resalta su originalidad y la persistencia de una línea seria de investigación. Resalta el enfrentamiento más científico de esta enfermedad propuesto por los autores.

Dr. Herrera: Resalta la calidad y la importancia de analizar esta patología a nivel de estudios moleculares. Estudios como este nos permiten acercarnos al entendimiento de las causas de esta enfermedad a nivel genético, ya que esta patología es más frecuente solo en algunas regiones del mundo incluyendo a Chile.

Dr. Germain: Efectivamente es necesario redefinir esta enfermedad. Las pacientes que se presentan con prurito palmo-plantar nocturno, tienen un riesgo perinatal variable, según la presencia o no de alteraciones en sus estudios de laboratorio. Esto es importante en términos de salud pública al momento de decidir intervenciones obstétricas sobre este grupo de pacientes, algunas de las cuales son innecesarias.
Esta enfermedad ha disminuido su incidencia de 6 a 7% a 0,8% en nuestro país. Ha aumentado en otros sectores del mundo con los cuales compartimos algunas características demográficas como el sur de California y Santa Cruz, Bolivia. Esto es material de estudio actual.


Proyectos: Financiado por FONDECYT #1980964, DIPUC 97II/12 CE, y I/98 Laboratorio Gynopharm, Grupo Recalcine.

*Trabajo de ingreso del Dr. Alfredo Germain A., leído en la sesión del 16 de abril de la Sociedad Chilena de Obstetricia y Ginecología.