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Revista chilena de anatomía

versión impresa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.20 n.1 Temuco  2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98682002000100005 

EFECTO DEL PARATHION SOBRE EL ÍNDICE DE APOPTOSIS EN
HEPATOCITOS DE RATONES CF1

EFFECT OF PARATHION ON THE APOPTOSIS OF CF1 MOUSE HEPATOCYTES

*Omar Espinoza; ** Eduardo Bustos-Obregón; *** José A. Suja.

* Departamento de Biología y Salud, Facultad de Ciencias, Universidad de Tarapacá, Arica,  Chile.
** Programa de Morfología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile,  Santiago, Chile.
*** Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid,  España.

En las últimas décadas el uso masivo de agropesticidas órganofosforados, como Parathion y Malathion, ha permitido el control de plagas en la producción hortofrutícola, mejorando la productividad e incrementando la oferta de alimentos de mayor calidad. Sin embargo, pese a su efectividad, estos compuestos químicos son potenciales causantes de daños morfológicos y genéticos, de alto riesgo para la Salud Humana y animal (Draper, 1985; Rodríguez y Bustos-Obregón, 2000). El parathion" (PT), inhibidor de la acetilcolinesterasa, se metaboliza en hígado, pulmón y cerebro. El efecto tóxico se debe a un proceso de desulfuración oxidativa hepática, que transforma el PT en paraoxon (PO), siendo éste su metabolito activo (Chambers y Chambers, 1990; Siller et al., 1997). El objetivo del presente trabajo es evaluar los efectos de una dosis única de PT sobre los índices de apoptosis en hepatocitos de ratón CF1.

Se usaron ratones macho CF1 de 8 a 10 semanas, con un peso promedio de 30 g, a los cuales se les aplicó una dosis intraperitoneal única de PT de 20 mg/Kg de peso (Sobarzo y Bustos-Obregón, 2000). Posteriormente fueron sacrificados a 1, 8, 16, 28 y 50 días postratamiento. El análisis histológico del hígado se realizó mediante microscopía óptica sobre cortes teñidos con hematoxilina/eosina  en que se analizó la presencia y frecuencia de hepatocitos apoptóticos.

Los resultados obtenidos permiten demostrar el efecto del PT sobre el hepatocito con un aumento estadísticamente significativo de apoptosis.

Se postula que el PT es carcinogénico, que bloquea o modifica la capacidad de replicación de los hepatocitos, alterando la susceptibilidad del tejido hepático (Fausto, 2000Metcalfe y Streuli, 1997). Se concluye que el PT tiene un efecto tóxico, aún en dosis consideradas bajas, aumentando significativamente los índices de eventos apoptóticos, alterando el ciclo celular y afectando la histofisiología del tejido hepático.

PALABRAS CLAVE: 1. Parathion; 2. Hígado; 3. Apoptosis

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas la necesidad de producir alimentos en mayor y mejor calidad, ha permitido un gran desarrollo de la agroindustria, con mejores agentes químicos para controlar las plagas agrícolas.

Sin embargo, otras especies, incluyendo el Hombre, también pueden ser afectadas por estos agroquímicos, ya sea por intoxicación aguda o crónica (Wesseling et al., 1997).

Parathion® y Malathion® son los insecticidas órganofosforados más usados en el mundo, supuestamente menos dañinos para la especie humana, con gran poder residual y vida media relativamente corta.

Parathion: El Parathion (PT) (dietil p-nitrofenil fosfotioato) es un insecticida de contacto, de amplio espectro, que se absorbe por la piel, tracto digestivo y sistema respiratorio.

Su acción tóxica se explica por la desulfuración oxidativa vía oxidasas microsomales hepáticas, mediada por citocromos P-450, y su activación a Paraoxon (PO) y otros metabolitos.

El paraoxon (PO) inhibe irreversiblemente la actividad de la enzima acetilcolinesterasa, acumulándose así,  acetilcolina que es responsable de las manifestaciones clínicas de la intoxicación. (Chambers & Chambers, 1990Siller et al., 1997 y Goodman & Gilman, 1990).

La intoxicación crónica implica una exposición en un lapso largo de tiempo a dosis bajas con daño a órganos y sistemas específicos como: hígado, riñón, aparato reproductor y sistemas nervioso central y periférico (Draper, 1985 y Rodríguez & Bustos-Obregón, 2000).

Otros trabajos han demostrado que el daño provocado por estos compuestos órganofosforados generan aumento de teratospermia en animales de laboratorio (Espinoza et al., 1994) y  aumento en los índices de micronúcleos en el epitelio intestinal (Espinoza et al., 1999).

Hígado: El hígado es la mayor y más grande masa glandular del organismo, recibiendo la sangre venosa del tubo digestivo, páncreas y bazo, lo que lo convierte en el primer órgano en recibir los substratos metabólicos y nutrientes. Por esto, el hígado está expuesto a las sustancias tóxicas que son absorbidas, degradadas o conjugadas.

Los hepatocitos son células poligonales que miden entre 20 y 30 micrones de diámetro y constituyen el 80% del total de la población celular del hígado. Sus núcleos son grandes, esféricos y de posición central, con dos o más nucléolos. La heterocromatina se presenta como agrupaciones distribuidas en el nucleoplasma en forma perinuclear. Muchos hepatocitos son binucleados, tetraploides con la correspondiente carga de ADN (4n).

La estimulación de retículo endoplasmático liso por drogas, como el etanol, aumenta la capacidad de detoxificación de drogas carcinogénicas y de algunos pesticidas. Por otro lado, puede hacer más tóxicos algunos compuestos como el tetracloruro de carbono y el benzopireno (Ross, 1995).

Los hepatocitos tienen gran promedio de vida y alta capacidad de regeneración cuando hay pérdidas por procesos hepatotóxicos, enfermedades o cirugía.

La mantención de los tipos celulares y el número de células en eucariontes multicelulares depende de un continuo balance entre proliferación celular y muerte celular programada o apoptosis. En este estudio se analizan poblaciones celulares de hepatocitos, que sufren apoptosis por acción del PT.

Apoptosis: Está referida a un proceso que ocurre en las células, en condiciones fisiológicas normales (Wyllie et al., 1980). Este proceso ocurre también durante el desarrollo embrionario, período en el cual se produce una destrucción celular programada selectiva, que involucra la producción de células que luego se vuelven prescindibles y mueren (Robbins, 2000).

Las perturbaciones del balance entre la proliferación celular y la pérdida de células por apoptosis, juegan un rol importante en mediar o modificar la acción de carcinógenos u otros tóxicos en tejidos del hígado, cerebro, sistema inmune, tracto digestivo y de los órganos reproductores (Roberts et al., 1997 y Bustos-Obregón et al., 1998).

La apoptosis afecta, por lo general, a células individuales, induciendo condensación de la cromatina, acompañada de destrucción proteolítica de la lámina nuclear. Las células apoptóticas son fagocitadas por células vecinas, evitando así reacciones inflamatorias y lesión tisular, a diferencia de la necrosis, en la cual un gran grupo de células contiguas son afectadas por procesos inflamatorios (Terranova & Taylor, 1999).

En células hepáticas la apoptosis ocurre en primer lugar como un estado normal durante el desarrollo del hígado y luego, en el adulto, durante la regeneración del órgano y renovación de hepatocitos .

El hígado, por ser lugar de llegada de muchos tóxicos, está en un proceso de continuo equilibrio entre proliferación y apoptosis. Los hepatocitos tienen una gran capacidad de replicación y son capaces de repoblar el hígado. No obstante, esta capacidad puede ser bloqueada o demorada por factores internos o externos, alterando la susceptibilidad de los tejidos frente a diferentes compuestos carcinogénicos (Fausto, 2000Metcalfe & Streuli, 1997).

El objetivo de este estudio es determinar el efecto de PT sobre los niveles de apoptosis en hepatocitos de ratón CF1, después de una dosis intraperitoneal única de 20 mg/Kg de peso del animal, a diferentes estadios de sobrevida.

MATERIAL Y MÉTODO

El estudio se realizó en ratones macho, cepa CF1,  de 8 a 10 semanas de edad, con un peso promedio de 30 g. Los animales se mantuvieron a 18-20ºC, con agua y alimento comercial certificado "ad libitum" y fotoperíodo natural.

Diseño experimental: Sesenta animales fueron divididos en grupos controles y grupos tratados (N = 30), los cuales se subdividieron en conjuntos de 6 individuos cada uno, para evaluar los períodos de 1, 8, 16, 28 y 50 días postratamiento. Al grupo de ratones tratados se les inyectó Parathion" (0,0 diethyl o-p-nitrophenylmonophosphate  99,2%, Sigma) diluido en una solución de NaCl 0,85%, por vía intraperitoneal, dosis única de 20 mg/Kg de peso del animal (1/3 LD50, Sobarzo & Bustos-Obregón, 2000). El grupo control fue inyectado con NaCl 0.85%.

Los animales control y los tratados fueron sacrificados por dislocación cervical a los 1, 8, 16, 28 y 50 días postinyección (p.i.), para luego extirparles el hígado.

El tejido hepático se fijó en Bouin durante 12 horas y se deshidrató en una  batería de alcoholes. A continuación se incluyó en parafina y fue seccionado  a 5µm y teñido con hematoxilina/eosina.

Observación y recuento:La observación de la histología hepática se realizó en microscopía óptica a 400 X (campo de 166.000 µm2). En cada campo se analizaron de 200 a 250 hepatocitos, completando un total de 1500 células analizadas por individuo (Wilson & Potten, 1999 y Willingham, 1999).

Se contaron hepatocitos en apoptosis y hepatocitos binucleados. Los hepatocitos cuyos núcleos presentan una marcada picnosis (hipercromasia), organización nuclear desordenada y visible fragmentación cromatínica, fueron catalogados como apoptóticos   (Susin et al., 2000).

Análisis estadístico:Los resultados obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante el test de varianza para grupos no paramétricos de Wilcoxon, (p<0,05).

RESULTADOS

La observación y recuento de células muestra un aumento significativo de hepatocitos en apoptosis, en todos los períodos postratamiento con PT, alcanzando sus máximos valores el día 16  (Gráfico I).



Gráfico I. Se muestra el índice de apoptosis (%) encontrado a distintos días postratamien-to, tanto en ratones control como en ratones tratados con PT. Se observa que el PT altera la fisiología hepática induciendo una alta tasa de apoptosis en los hepatocitos, bajo las condiciones experimentales ensayadas y durante cada uno de los tiempos de análisis. Adicionalmente, se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p< 0,005) entre los datos control y los experimentales, a través de los intervalos de tiempo.

En la Tabla I se observan las tasas diferenciales entre la apoptosis basal y la apoptosis postratamiento.

Tabla I. Tasa diferencial de apoptosis, expresada como porcentajes, (apoptosis inducida con PT - apoptosis basal) en ratones CF 1. En la tabla se muestra que la inducción de apoptosis, por dosis única de PT, supera los valores de apoptosis basal, alcanzándose el mayor efecto al día 16 postinyección, aunque se observa una disminución significativa a los 28 días postratamiento. Esta disminución expresa probablemente la capacidad detoxificante del hígado tratando de alcanzar el balance entre renovación y apoptosis. El promedio diferencial alcanza un valor de 10,37%, que representaría el efecto neto de inducción de apoptosis por tratamiento de PT.

Período p. i.
Apoptosis basal Apoptosis post- tratamiento Tasa diferencial.

1 día

5,30 15,50 10,20
8 días
4,85 14,67 09,82
16 días 6,17 19,23
13,06
28 días
8,50
15,40 06,90
50 días 4,57
16,05
11,90
Promedio
5,87 16,26 10,37

El Gráfico II expresa los índices de hepatocitos binucleados, entre ambos grupos de estudio, centrando la atención en el día 16 postratamiento, donde la diferencia entre tratado y control es estadísticamente significativo (p<0,05)


Gráfico II. Índice de hepatocitos binucleados en el grupo control y el tratado con PT en distintos días postinyección. En todos los grupos tratados el número de células binucleadas fue mayor que en el grupo control, si bien las diferencias no son estadísticamente significativas, excepto para el período de 16 días, lo que indicaría que PT altera el proceso del ciclo celular desencadenando procesos de endomitosis.

El Gráfico III muestra el recuento de hepatocitos en un campo de 166.000 µm2, tanto para grupos controles como para tratados.  Las diferencias son estadísticamente significativas en los períodos de 8 y 28 días. Este incremento se explicaría por una disminución en el tamaño de los hepatocitos que empiezan a entrar en apoptosis.


Gráfico III. Número total de células por campo al microscopio (400X),  (166.000 µm2), en los grupos control y tratados con PT. El grupo control se considera 100% para su comparación con los grupos tratados en los diferentes períodos postratamiento. La comparación del recuento de células entre los grupos de estudio muestra que en todos los períodos postratamiento con PT, hay una mayor cantidad de células. Estos aumentos porcentuales sólo se hacen  significativos los días 8 y 28 postratamiento. Estos resultados se explicarían postulando que en estos períodos se produciría una disminución de tamaño de los hepatocitos, o sea que hay un mayor número de células en la misma área de recuento.

Las fotografías de las secciones histológicas teñidas con hematoxilina/eosina, muestran la presencia de hepatocitos con núcleos marcadamente picnóticos.

La Fig.1 muestra hepatocitos a los 8 días postratamiento. Las flechas indican hepatocitos en apoptosis con una marcada hiperpicnosis.  Hay una disminución en el tamaño de los hepatocitos.


Fig. 1.  Tejido hepático después de 8 días postratamiento con PT. x1100. Se observa la presencia de hepatocitos con núcleos hiperpicnóticos y marcada condensación de la cromatina (cabezas de flecha) que indican altas tasas de apoptosis con una tasa promedio de 14,67% respecto al porcentaje encontrados en hepatocitos control de igual período (véase Tabla I). La observación y comparación entre fotografía de ratones tratados y ratones control (Figura 3) permite detectar que los hepatocitos tratados con PT son de menor tamaño, como se indica además en el Gráfico III.

La Fig. 2 muestra un hepatocito binucleado a los 28 días postratamiento, con ambos núcleos picnóticos.

Fig. 2.  Hepatocito binucleado a los 28 días postratamiento en el cual ambos núcleos (cabezas de flechas) presentan picnosis cromatínica indicando apoptosis. x 2500.

En la Fig. 3 se observan hepatocitos, del grupo control de 8 días. Estas células tienen un tamaño mayor al grupo de igual período tratado con PT. (Comparar con Fig. 1).

Fig. 3.  Corte histológico del hígado de un ratón control tras 8 días de tratamiento. Se observa una constitución normal con hepatocitos muy bien estructurados y de evidente mayor tamaño que hepatocitos tratados. La cabeza de flecha indica un núcleo apoptótico (promedio normal  de apoptosis basal de 4,85%). x 1100.

DISCUSIÓN

Este estudio  demuestra que la apoptosis  producida por tratamiento con PT, a diferentes intervalos de tiempo aumenta significativamente, expresadas en núcleos de hepatocitos hiperpicnóticos, condensación de la cromatina y disminución en el tamaño celular, al igual como lo informa Studzinki (1999).

En el Gráfico 1 y Tabla I se muestra que el aumento de apoptosis, es significativamente mayor en ratones CF1 tratados, observándose que los cambios ya se expresan a las 24 horas postratamiento, indicando que PT es un citotóxico que altera el comportamiento de los hepatocitos, provocando daño al tejido hepático (Roberts et al.).

Los mayores eventos apoptóticos se observan al día 16 postratamiento, acompañados de un aumento significativo de células binucleadas, lo  que indicaría que en este intervalo, se encuentra el período crítico entre ganancia de células por mitosis y pérdidas de ellas por apoptosis. Las altas tasas de apoptosis en hepatocitos, serían corregidas por un aumento en los procesos de endomitosis (Metcalfe & Streuli y Fausto).

Por el contrario, el día 28 postratamiento, se encuentran los valores más bajos de apoptosis, indicando que a este período se expresa el mayor poder detoxificante del hígado, por acción de las carboxilasas y/o fagocitosis de células apoptóticas por células vecinas (Richardson, 1995 y Terranova & Taylor).

Sin embargo, al analizar el número total de células contadas y el recuento encontrado en todos los grupos tratados con PT, se infiere que el tamaño de las células tiende a disminuir. Estos valores alcanzan significancia estadística en los períodos de 8 y 28 días postratamiento (Gráfico III). Esto señala que el primer indicador de apoptosis en hepatocitos es la disminución del tamaño nuclear y volumen de la célula (Terranova & Taylor).

Los índices de apoptosis basal en los ratones controles CF1, (5,87%), indican que la apoptosis ocurre como un estado normal en la fisiología hepática (Tabla I), similar al  comportamiento encontrado en hepatocitos en cultivo (Feldman, 1997 y Lee et al., 1999).

Se postula que PT, (insecticida órgano fosforado), por sus propiedades lipofílicas, altera la permeabilidad de las membranas celulares de los hepatocitos, afectando la actividad de la proteína kinasa C (PKC) o bien al fenómeno de cascada, iniciado por las caspasas y la catepsina B (Jones et al., 1997; Christensen et al., 1998 y Faubion et al., 1999).

PT, por su acción inhibitoria sobre la actividad de la acetil colinesterasa, magnifica los signos parasimpáticos, provocando vaso constricción y afectando el riego sanguíneo del hígado, el cual podría ser otro factor que gatillaría el proceso de apoptosis (Sasaki et al., 1997).

Se concluye que PT, aún en dosis consideradas bajas, tiene un efecto claramente citotóxico, expresado en aumento significativo de apoptosis, modificando o bloqueando la capacidad de replicación de los hepatocitos, alterando el ciclo celular y la homeostasis del tejido hepático.

SUMMARY: Chemical environmental pollution is a major problem at present. Agropesticides are relevant in this regard, since they affect human and animal  health (Draper, 1985; Rodríguez & Bustos-Obregón, 2000). Parathion" (PT), an organophosphorate pesticide inhibits acetylcholinesterase and is metabolized in liver, lung and brain. It is transformed in paraoxon (PO), its active metabolite (Chambers & Chambers, 1990 and  Siller et al., 1997).

This work analizes the effect of a single dose of PT on the apoptotic index of CF1 mouse hepatocytes.

Male CF1 mice (8 to 10 weeks old, average weight of 30 g) were treated with a single injection of PT, of 20 mg/Kg body weight (Sobarzo & Bustos-Obregón, 2000). The animals were sacrificed at 1, 8, 16, 28 and 50 days after injection.

Histological analysis of hepatic tissue was done by light microscopy for counting of apoptotic (and binucleated) cells in HE stained slides.

It has been postulated that PT is carcinogenic and that it modifies the ability of hepatocytes to regenerate (Metcalfe & Streuli, 1997 and Fausto, 2000).

We conclude that PT is cytotoxic even at low concentrations, since it increases apoptosis and affects the normal homeostasis of the hepatic tissue.

KEY WORDS: 1. Parathion; 2. Liver; 3. Apoptosis.

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Dirección para correspondencia:
Prof. Dr. Eduardo Bustos-Obregón
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Casilla 70061 - Correo 7
Santiago
CHILE

Email: ebustos@machi.med.uchile.cl

Recibido : 16-11-2001
Aceptado : 28-12-2001