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Revista chilena de anatomía

versión impresa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.18 n.1 Temuco  2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98682000000100015 

LOCALIZACION INMUNOCITOQUIMICA DE LA SERPINA CBG-símil EN EL
SISTEMA REPRODUCTOR DE MAMÍFEROS HEMBRA

IMMUNOCYTOCHEMICAL LOCALIZATION OF THE CBG-like IN THE
MAMMALIAN FEMALE REPRODUCTIVE SYSTEM

* Vásquez, B.
* Peña, P.
** Veuthey, C.
* Sánchez, R.

*** Miska, W. * Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
** Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.
*** Departamento de Dermatología y Andrología, JL-Universität Giessen, Alemania.
Financiado por DIDUFRO 9735 y DFG-GTZ-93.2157.1-06.100.

RESUMEN: La participación de la globulina que une corticoides (CBG) en el proceso de la inducción de la reacción acrosomal, ha sido claramente demostrada in vitro en espermatozoides humanos. Esta molécula fue aislada primariamente desde fluido folicular y su presencia, detectada inmunológicamente, ha sido demostrada por nosotros en folículos ováricos, epitelio tubular uterino y en endometrio de humanos y bovinos. Estos resultados nos llevaron a ampliar el estudio de la probable presencia de esta molécula en otras especies mamíferas, con la hipótesis de que si está involucrada en mecanismos previos a la fecundación en humanos y bovinos, su presencia podría estar también jugando un rol modulatorio en especies con procesos de interacción gamética básicamente comparables.

El objetivo del presente trabajo fue determinar inmunocitoquímicamente la presencia y distribución de la CBG-símil en el sistema reproductor de cerdos, perros, gatos, conejos y ratas. Las muestras fueron obtenidas, en los distintos estadios del ciclo reproductivo, desde piezas quirúrgicas, a excepción de las de cerdo que se obtuvieron desde un matadero local. Muestras de ovario, tuba uterina y útero fueron procesadas para la inmunocitoquímica (ICQ) con anticuerpos (Ac) poli y monoclonales anti hCBG que reconocieron antígenos comunes dentro de las distintas especies animales. En todas ellas la ICQ reveló una intensa reacción positiva a nivel de los folículos ováricos, en las células secretoras del epitelio de la mucosa tubárica y en las células epiteliales de las glándulas y de la mucosa endometrial. En general, la inmuno tinción se manifestó muy intensa hacia el periodo ovulatorio y muy escasa en los periodos de niveles esteroidales bajos. Sin embargo, existieron diferencias particulares entre los distintos animales debido, probablemente, a la variación antigénica por la lejanía de la especie con la molécula generadora del Ac. Muy interesante resultó el estudio del animal en el cual se produjo el Ac policlonal, éste confirmó la presencia de la CBG endógena, determinada por una intensa inmunorreactividad en los preparados controles (sin Ac específico), y que por tanto, la única fuente de ellos fue la proveniente de la generación de sus propios Ac. Nuestros resultados nos permiten sugerir que en las especies estudiadas existe CBG-símil, la cual se distribuye en áreas morfológicas del sistema reproductor, similares a las observadas en humanos y en bovinos, lo cual puede estar indicando que esta molécula también podría estar involucrada en sus correspondientes procesos reproductivos. Sin embargo, su directa participación en mecanismos fisiológicos, como por ejemplo la Reacción Acrosomal, hasta el presente, no ha sido demostrada.

PALABRAS CLAVE: 1. CBG; 2. Mamíferos; 3. Inmunocitoquímica; 4. Ovarios; 5. Útero; 6. Tuba uterina.

INTRODUCCIÓN

La fecundación en las especies mamíferas requiere de complejos mecanismos, entre los cuales se encuentra la capacitación espermática. Este fenómeno que, normalmente, ocurre en el tracto genital femenino (AUSTIN, 1951; CHANG, 1951), implica eventos, no del todo conocidos,

que finalmente posibilitan a la membrana plasmática del espermatozoide fusionarse con la membrana acrosomal externa, desencadenando la reacción acrosomal (RA) y la liberación al medio de las enzimas acrosomales (Yanagimachi & Usui, 1974). Hasta el momento se han descrito una serie de agentes inductores de la RA, entre otros, ionóforos de calcio (BYRD & WOLF, 1986), zona pelúcida (FLORMAN et al., 1982; CROOS et al., 1988), fluido folicular (TESARIK, 1985; CALVO et al., 1989; REVELLI et al., 1992; FEHL & MISKA, 1994 y FEHL et al., 1995), y esteroides presentes en él, tales como la progesterona, cuya concentración efectiva para inducir la estimulación de la RA se ha establecido en el rango de 1-3 µg/ml (OSMAN et al., 1989; PILLAI & MEIZEL, 1991; MORALES et al., 1992; Tesarik & Mendoza, 1992; MENDOZA et al., 1993 y YANG et al., 1994). Por otra parte, la RA ha sido observada aún en fluidos foliculares libres de esteroides (MBIZVO et al., 1990; MORALES et al. y FEHL & MISKA, 1994). Los aparentes resultados contrapuestos que presentaron los esteroides introdujo la idea de que existiría algún otro elemento, de naturaleza química distinta, que estaría involucrado en el desencadenamiento de la RA.

MISKA et al. (1994), trabajando con fluido folicular humano, aislaron una globulina que une corticoide (CBG). El gen de esta molécula fue localizado en el cromosoma catorce, descubriéndose que su estructura primaria, tiene más de un 30% de homología con la superfamilia de las serpinas (serina inhibidora de proteinasas), pero que su función sólo deriva hacia el transporte de esteroides, perdiendo su capacidad sérica de inhibición (ROSNER, 1991). En ensayos in vitro, se demostró que ésta molécula, unida con progesterona y en concentraciones fisiológicas, participa en forma directa en la inducción de la RA en espermatozoides humanos (BALTES et al., 1995 y Sánchez et al., 1997). La presencia en el fluido folicular del complejo CBG-P restringe su origen a los elementos celulares que constituyen el folículo (Cummulus oophorus, granulosa). Las células del Cummulus oophorus (CO) y granulosa son la principal fuente de progesterona durante el período preovulatorio y la sola incubación de espermatozoides con células del CO incrementa hasta tres veces los valores de la RA en relación a su control (STOCK et al., 1989). Efectos similares se han observados en bovinos; la coincubación de espermatozoides con el complejo Cummulus-ovocito produjo un notorio aumento de reacción acrosómica comparado con incubaciones sin CO (FUKUI, 1990).

Mediante detección inmunocitoquímica (ICQ) con anticuerpos monoclonales, PEÑA et al., (1996) y BALTES et al., (1998) localizaron en humanos CBG inmunorreactiva en células específicas de estructuras como CO, granulosa, en mucosa tubárica uterina, además de encontrarse en células del epitelio y glándulas endometriales. Posteriormente, utilizando también ICQ, PEÑA et al., 1999 confirmaron su presencia en sitios similares en el sistema reproductor de bovino. Estos antecedentes permiten sugerir que la CBG esta involucrada directamente, mediante su participación en la RA, en eventos previos a la fecundación en humanos y, posiblemente, en la especie bovina.

El objetivo de éste estudio fue determinar mediante ICQ, la probable presencia de CBG en los sistemas reproductor de hembras de cerdas, perras, gatas, conejas y ratas. Ya que si esta molécula está involucrada en mecanismos reproductivos básicos, su participación podría estar también conservada en otras especies del filum. Dado que la CBG, vinculada al sistema reproductor se ha aislado solamente en la especie humana, su estudio fue realizado utilizando un anticuerpo policlonal capaz de reconocer determinantes antigénicos comunes para las distintas especies mamíferas estudiadas.

MATERIAL Y MÉTODO

Inmunización: Para la obtención del anticuerpo (Ac) policlonal anti Serpina hCBG (Biogenesis, Inglaterra) se inmunizó una coneja, raza híbrida, de 6 meses de edad, 1.5 kg de peso. La CBG fue disuelta en PBS y mezclada, según la inmunización, en volúmenes iguales. La 1ª , con Coadyuvante Completo de Freund (CCF, Sigma F-5881), la 2ª, con Coadyuvante incompleto de Freund (CIF, Sigma F-5506) y la 3ª, sólo con el vehículo. Después de cada sangría, los sueros fueron congelados y mantenidos a -20ºC.

Muestras de tejidos. Las muestras de ovarios, tubas uterinas y úteros de cerdos (Sus scrofa), fueron colectadas de un matadero local y transportadas al laboratorio en solución salina enfriada en hielo. Las muestras de perros (Canis familiaris), gatos (Felis catus), conejos (Oryctolagus cunniculus) y ratas (Ratus norvergicus) fueron obtenidas de piezas quirúrgicas. La coneja inmunizada para la producción del Ac policlonal (-) hCBG, después de la sangría final, fue sacrificada tomándose muestras de su sistema reproductor. Inmediatamente todos los tejidos fueron fijados en Methacarn, fijador tipo Carnoy, (PEÑA et al., 1996) y procesados para la inclusión en paraplast. Posteriormente, se realizaron cortes seriados de 5-7 µm, los cuales se montaron en portaobjetos con poly-l-lysina (Sigma P-1524). El estudio morfológico (hematoxilina-eosina e inmunocitoquímica) y las fotografías se realizaron con un microscopio Carl Zeiss, Axiolab, con cámara MC 80 DX.

Inmunocitoquímica: La ICQ se realizó por el método del PAP según técnica del segundo Ac (Sternberger et al., 1970). En la serie monoclonal, realizada en la coneja en la cual se hizo el Ac anti Serpina hCBG: el Ac específico fue (-) hCBG (Biogenesis, Inglaterra) y la dilución usada fue de 1/50, el 2º Ac: Dako Z0109 y el PAP, ratón Dako P0850. En la serie policlonal, realizada también en esta coneja y en las muestras de los otros animales en estudio, el Ac específico fue un policlonal (-) hCBG obtenido en conejo (Biogenesis Inc, USA; y de propia producción), la dilución usada para este Ac varía según la especie; en cerdas y perras correspondió a una dilución de 1/30, en gatas 1/10, conejas y ratas a 1/50. El 2º Ac fue: Dako Z0196 y el PAP, conejo Dako Z0113. El revelado de la inmunotinción se realizó con 3,3'- diaminobenzidina (Sigma, D-5637), en presencia de H2O2 (Merck 1.07210).

Los controles negativos fueron realizados en cortes seriados, vecinos a los inmunopositivos, por incu-bación con sueros de conejos no inmunes. Los controles positivos se realizaron utilizando hígado humano para las dos series de anticuerpos. Una vez finalizada la reacción, los preparados fueron teñidos con Hematoxilina por 10-30 segundos, como tinción de contraste nuclear. El montaje se realizó con Permount (Fisher, USA).

RESULTADOS

Los análisis morfológicos realizados con Hematoxilina-eosina corroboraron la histología normal de los tejidos. Los resultados obtenidos con ICQ, fueron los siguientes:

A nivel ovárico se observó una intensa y selectiva reacción inmunopositiva (marcaje color café, tipo granular, distribuido en el citoplasma) en células foliculares, material floculado del fluido folicular y en células de la teca interna de los folículos ováricos. La distribución de la CBG en este tipo de células, siguió patrones similares en todas las especies estudiadas y la inmunotinción fue más intensa, en aquellos folículos que se encontraban en un estadio más avanzado de maduración. Estos resultados contrastan, nítidamente, con los controles negativos realizados en cortes adyacentes y en que sólo se destaca la tinción de contraste nuclear (Fig. 1).

Fig. 1. Inmunocitoquímica anti CBG en folículos ovári-cos de cerdos.
A) Intensa inmunorreacción en células de la granulosa y en ciertas de la teca interna.
B) Control inmunocitoquí-mico negativo en cortes seriados vecinos. (400X).

El epitelio de revestimiento de la tuba uterina reveló inmunorreacción positiva, específicamente en el citoplasma apical de las células secretoras, variando claramente su intensidad según la etapa del ciclo estral en que se encontraban los animales en estudio. Es decir, en aquellas tubas correspondientes a animales en estro, estas células se presentaron llenas de secreción, observándose una morfología típica de tipo columnar y en donde la inmunotinción mostraba una mayor intensidad. En los controles de cada condición, no se observó inmunotinción en ninguna estructura (Fig. 2). Por otro lado, a nivel endometrial, se observó también inmunorreacción en las células epiteliales de la mucosa y en las células glandulares. Estos resultados se repiten sistemáticamente en todas las especies. El tejido endometrial que corresponde al inicio de la fase proliferativa o estrogénica, se presenta con gran actividad mitótica, tanto en las células estromales como en las glándulas y el tejido epitelial, corresponde principalmente al tipo cuboídeo.

Fig. 2. Inmunocitoquímica anti CBG en tuba uterina de gatas y cerdas.
A y B) Intensa inmunorreac-ción en ciertas células del epitelio tubárico.
C) Control inmunocitoquí-mico negativo en cortes seriados vecinos. (400X).

En estas condiciones, la inmunotinción para la CBG es más bien débil o de baja intensidad, para ir aumentando paulatinamente al final de esta fase y al comienzo de la etapa secretora o progestativa, donde las células epiteliales son columnares y las glándulas secretoras se hacen más tortuosas, aumentando de tamaño, asemejándose a la imagen de un epitelio tipo pseudoestratificado y con gran acumulación de material secretor (Fig. 3).

Fig. 3. Inmunocitoquímica anti CBG en mucosa endo-metrial de perras y ratas. A) Inmunorreacción positiva en células epiteliales de la mucosa endometrial de perras, correspondientes al inicio de la fase proliferativa.
B) Intensa inmunorreacción en células epiteliales de la mucosa endometrial de ratas, correspondientes a una etapa más avanzada del ciclo.
C) Control inmunocitoquí-mico negativo en cortes seriados de rata, vecinos a los inmunopositivos. (400X).

Por su parte, en la coneja en la cual se desarrolló el anticuerpo, la histología no mostró variaciones sustanciales en los tejidos y estructuras, que se pudieran diferenciar de las muestras provenientes de animales no inmunizados. Sin embargo, la ICQ reveló una muy intensa inmunorreacción homogénea, de tipo granular, en todo el citoplasma de células de la granulosa, de la teca interna, en los tipos secretores del epitelio tubárico y en las glándulas y mucosa endometrial. Pero además, existió una intensa reacción, en el caso de la tuba ovárica, en el tejido conectivo que acompaña a la mucosa. La inmuno-positividad se presentó tanto para los cortes que fueron incubados con el anticuerpo específico (1º Ac, policlonal anti CBG) como para los cortes controles, los cuales no fueron incubados con dicho anticuerpo, sino sólo con suero no inmune (Fig. 4).


Fig. 4. Inmunocitoquímica anti CBG en tuba uterina del coneja inmunizada. Intensa inmunorreacción en cortes controles, los cuales no fueron incubados con el 1° Ac (policlonal), sino sólo, con suero no inmune. (400X).

Es de especial interés que los resultados observados anteriormente, no se repiten cuando se utilizaron anticuerpos monoclonales. En este último caso, se mantiene toda la inmunopositividad en las estructuras y células antes descritas sólo cuando se realizó la incubación con el 1º Ac específico y ésta desapareció completamente en los cortes incubados sin el 1º Ac (Fig. 5).


Fig. 5. Inmunocitoquímica anti CBG en mucosa endometrial de coneja inmunizada. Intensa inmunorreacción de tipo granular en ciertas células epiteliales de la mucosa endometrial, realizada con la seria monoclonal. B) Control inmunocitoquímico negativo en cortes seriados vecinos. (400X).

DISCUSIÓN

En su trayecto para encontrarse con el ovocito, los espermatozoides son expuestos a secreciones producidas por el tracto genital femenino. En la actualidad, es ampliamente aceptado que el contenido proteico del líquido folicular y los esteroides ováricos, estrógeno y progesterona, no sólo juegan un rol en la maduración del ovocito y la preparación del útero, sino que también influyen modulando funciones espermáticas tales como motilidad, capacitación y reacción acrosómica (CALVO et al.; FALCONE et al.,1991; REVELLI et al.; TESARIK, 1985; FEHL & MISKA, 1994 y FEHL et al., 1995). En el proceso de la fecundación misma, específicamente en el encuentro de ambos gametos, el ambiente bioquímico que otorga el fluido tubárico y, por ende las estructuras involucradas en su formación, constituyen un punto de particular interés en la modulación de la interacción gamética. Por ello, el estudio morfofuncional de la tuba uterina es esencial para la comprensión de fenómenos que allí ocurren y que aún no han sido del todo dilucidados. Más aún, cuando el análisis morfológico convencional, revela un epitelio tubular de tipo cúbico simple y con una importante población celular clásicamente descrita como secretora de proteínas pero de las cuales, se carece de estudios que se aproximen a la naturaleza bioquímica específica del contenido de esa secreción. Nuestro grupo ha identificado inmunocitoquímicamente, en la especie humana y bovinos, a la molécula de CBG, que está en grandes cantidades ocupando el citoplasma de estas células y con todas las probabilidades de que allí sea sintetizada, almacenada y liberada al medio. Este hecho tiene particular relevancia porque otorga un sustrato morfológico a los resultados aportados por MISKA, et al., con relación a la función que en humanos juega la CBG, que unida a progesterona, es capaz de inducir la reacción acrosomal en espermatozoides aislados. La CBG ha sido también descrita por nuestro grupo (no sólo en humanos) en otras áreas tales como componentes foliculares y en el epitelio endometrial, (PEÑA et al., 1995; Sánchez et al., 1995; BALTES et al., 1995; PEÑA et al., 1996 y BALTES et al., 1998).

Por otra parte, sólo hemos podido determinar la presencia de CBG a través de la ICQ, utilizando para ello un Ac policlonal contra hCBG, que ha sido capaz de reconocer determinantes antigénicas comunes, que a juzgar por la diferente reactividad expresada por las variaciones en las diluciones del Ac (que han sido necesarias para evidenciarla en las distintas especies) más apuntaría, a una molécula con variaciones ínter especies, que a una molécula similar en todas ellas. No obstante, la establecida participación in vitro de la CBG en la RA en humanos, hasta el presente, no ha sido probada ni para bovinos ni para el resto de las especies estudiadas. Así nuestros trabajos sugieren que la función de la CBG símil en relación con la reacción acrosomal, abarcaría también a otras especies mamíferas cuyos mecanismos reproductivos son básicamente comparables, y por tanto, la participación de la CBG podría indicar un proceso molecular similar.

Es evidente la directa modulación de los esteroides ováricos sobre la producción y funcionalidad efectora de la CBG debido a que la cantidad de los gránulos intracitoplasmáticos inmunorreactivos varían notablemente, en todas las especies estudiadas, con los estadios del ciclo ovárico, siendo claramente mayor hacia la mitad del ciclo y en el tercio siguiente de la fase endometrial proliferativa.

A su vez, el estudio inmunocitoquímico del animal en el cual se realizó el anticuerpo, demostró la presencia de la molécula de CBG-símil en su sistema reproductor. Debido a la inmunización contra hCBG el animal mantiene altos niveles de IgG anti hCBG circulante, la que vía sanguínea, mediante vasos del tejido conectivo de la mucosa tubárica, alcanzarían basalmente las células del epitelio, uniéndose a la molécula de CBG inmunorreactiva. De esta forma, el complejo antígeno-anticuerpo (CBG-antiCBG) es revelado cuando se continúa la ICQ, en que el 2º Ac, que es un Ac anti IgG de conejo, reconoce a su antígeno (la IgG anti CBG del complejo CBG-antiCBG citosólico) y como tal se continúa con la inmunorreacción hasta, finalmente, revelar la presencia de la molécula de CBG inmunoreactiva. Si no existiera la presencia de esta molécula dentro del citosol de las células tubáricas, la reacción no existiría y por tanto, se revelaría como negativo, fundamento éste de los controles negativos de la ICQ y que, en este caso, debido a la CBG endógena siguieron siendo positivos. Nada de ello ocurrió en la contraprueba, cuando se utilizaron Ac de la serie monoclonales y que aún cuando, se reconoce la CBG citosólica, no existe marcaje a nivel del tejido conectivo como existió en la coneja inmune y los controles fueron absolutamente negativos. La utilización de anticuerpos policlonales ha permitido una aproximación al estudio de la CBG en las distintas especies mamíferas, y su significado funcional específico en la RA-como en el caso humano- u otro rol funcional, está siendo estudiado.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Sr. Jorge Seguel V. del Laboratorio de Técnicas Histológicas del Depto. de Ciencias Básicas de la Universidad de La Frontera, por su asistencia técnica. Al Prof. Dr. Roberto Matamoros, de la Escuela de Medicina Veterinaria de la UCTEM, por su colaboración en la revisión y en la edición en el idioma Inglés del manuscrito.

SUMMARY: The role of the globulin that binds corticoids (CBG) in the induction process of the acrosome reaction, has been clearly shown in vitro in human spermatozoids. This molecule was isolated originally from follicular fluid and its presence was immunologically shown by our group in ovarian follicles, uterine tubular epithelium and human and bovine endometrium. These results has led us to perform other studies to demonstrate its presence in other mammals. Our hypothesis being that if this molecule is involved in the mechanisms previous to fertilization in human and bovine species, its presence could also have a modulator role in species with similar gamete interaction.

The objective of the present study was to determine the presence and distribution of a CBG-like molecule by immunocytochemistry in the reproductive system of pigs, dogs, cats, rabbits and rats. All samples were taken in every stage of the reproductive cycle for every species from surgical intervention except for the pig which was obtained from a local slaughterhouse (abattoir). Ovary, uterine tube and uterus samples were processed to the immunocytochemistry (ICQ) with anti hCBG poly and monoclonal antibodies (Ab) which recognized common antigens of the several species involved in the study. The ICQ revealed in every species an intense positive reaction at the level of ovarian follicles, secretory cells from the uterine tube epithelium and in the epithelial cells from the uterine glands and endometrium. Generally, the staining was very intensive near to the ovulatory stage and very scarce at the stages with lower steroid hormone concentration. However, there were differences among several species probably due to antigenic variability of each species in relation to the generator molecule of the antibody. There was a very interesting result with the animal from which a polyclonal antibody was obtained. This outcome was confirmed by the detection of endogenous CBG determined by an intensive immunoreaction in the controls (without specific antibody), therefore, the only possible source was the generation of its own endogenous antibodies.

Our results allow us to suggest the presence of a CBG-like molecule in the species of the present study and that the distribution of this molecule in the morphologic areas of the reproductive system was similar to those found in human and bovine samples which strongly suggest that this molecule could be also involved in their respective reproductive physiology. However, its direct participation in physiological mechanisms such as the acrosome reaction has not been yet shown.

KEY WORDS: 1. CBG; 2. Female mammals; 3. Immunocytochemistry; 4. Ovary; 5. Uterus; 6. Uterine tube.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AUSTIN, G. R. Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg. Aust J Sci Res B 4:581-96, 1951.         [ Links ]

Baltes, P.; Sánchez, R.; Schalles, U. K.; Villegas, J.; Peña, P.; Henkel, R.; Turley, H. & Miska, W. Origin and nature of the acrosome reaction-inducing substance (ARIS) of human follicular fluid (hFF). Human sperm acrosome reaction. Eds P. Fénichel, J. Parinaud. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd., Vol. 236, pp. 400-1, 1995.         [ Links ]

Baltes, P.; Sánchez, R.; Peña, P.; Villegas, J.; Turley, H. & Miska, W. Evidence for the synthesis and secretion of a CBG-like serpin by human cummulus oophorus and fallopian tubes. Andrologia, 30:249-53, 1998.         [ Links ]

Byrd, W. & Wolf, D. P. Acrosomal status in fresh and capacitated human ejaculated sperm. Biology of Reproduction, 34:859-69, 1986.         [ Links ]

Calvo, L.; Vantman, D.; Banks, S. M.; Tezon, J.; Koukoulis, G. N.; Dennison, L. & Sherins, R. J. Follicular fluid-induced acrosome reaction distinguishes a subgroup of men with unexplained infertility not identified by semen analysis. Fertil. Steril., 52(6):1048-54, 1989.         [ Links ]

CHANG, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature (Lond) 168:697-98, 1951.         [ Links ]

Cross, N.; Morales, P.; Overstreet, J. & Hanson, F. Induction of acrosome reactions by the human Zona pellucida. Biology of Reproduction, 38:235-44, 1988.         [ Links ]

Falcone, L.; Gianni, S.; Piffaretti-Yanez, A.; Marchini, M.; Eppenberger, U. & Balerna, M. Follicular fluid enhances sperm motility and velocity in vitro. Fertil. Steril., 55(3):619-23, 1991.         [ Links ]

FEHL, P. & MISKA, W. Untersuchungen zur Induktion der akrosomalen Reaktion menschlicher Spermatozoen durch humane Follikularflüssigkeit. Fetilität, 10:142-48, 1994.         [ Links ]

Fehl, P.; Miska, W. & Henkel, R. Further indications of the multi-component nature of the acrosome reaction-inducing substance (ARIS) of human follicular fluid. Molec. Reprod. Dev., 42:80-88, 1995.         [ Links ]

Florman, H. M. & Storey, B. T. Mouse gamete interactions: The zona pellucida is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro. Dev. Biol., 91:121-30, 1982.         [ Links ]

FUKUI, Y. Effect of follicle cells on the acrosome reaction, fertilization, and developmental competence of bovine oocytes matured in vitro. Mol. Reprod. Dev., 26(1):40-6, 1990.         [ Links ]

Miska, W.; Fehl, P. & Henkel, R. Biochemical and inmunological characterization of the acrosome reaction - inducing substance (ARIS) of hFF. Biochem Biophys Res Commun, 199(1):125-9, 1994.         [ Links ]

Mbizvo, M. T.; Burkman, L. J. & Alexander, N. J. Human follicular fluid stimulates hyperactivated motility in human sperm. Fertil. Steril., 54(4):708-12, 1990.         [ Links ]

Morales, P.; Llanos, M.; Gutierrez, G.; Kohen, P.; Vigil, P. & Vantman, D. The acrosome reaction-inducing activity of individual human follicular fluid samples is highly variable and is related to the steroid content. Hum. Reprod., 7(5):646-51, 1992.         [ Links ]

Osman, R. A.; Andria, M. L.; Jones, A. D. & Meizel, S. Steroid induced exocytosis: the human sperm acrosome reaction. Biochem Biophys Res. Commun., 160(2):828-33, 1989.         [ Links ]

Peña, P.; Risopatrón, J.; Miska, W.; Sepúlveda, N.; Villagrán, E. & Sánchez, R. Spermaaufbereitung zur In-vitro- Fertilization bei Rindern mittels Migration/Sedimentation im Vergleich zum Waschen/Zentrifugieren». 28.Tagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung. Gleichzeitig:20.Veterinaer-Humanmedizinische Gemeins-chaftstagung. Giessen (Germany), 9. und 10. Maerz, 1995.         [ Links ]

Peña, P.; Ureta, L.; Irribarra, V.; Soruco, M.; Risopatrón, J.; Sánchez, R. & Miska, W. Localización Immunocitoquímica de la serpina humana CBGir en tuba uterina de mujeres en diferentes estadios reproductivos. Rev. Chil. Anat., 14(2):227, 1996.         [ Links ]

Peña, P.; Vásquez, B.; Veuthey, C.; Risopatrón, J.; Sánchez, R. & Miska, W. Evidencias inmunocitoquímicas sobre la presencia de la serpina CBG-símil en el sistema reproductor de la hembra en bovinos. Rev. Chil. Anat., 17(2):197-203, 1999.         [ Links ]

Pillai, M. C. & Meizel, S. Trypsin inhibitors prevent the progesterone-initiated increase in intracellular calcium required for the human sperm acrosome reaction. J. Exp. Zool., 258(3):384-93, 1991.         [ Links ]

Revelli, A.; Soldati, G.; Stamm, J.; Massobrio, M.; Topfer-Petersen, E. & Balerna, M. Effect of volumetric mixtures of peritoneal and follicular fluid from the same woman on sperm motility and acrosomal reactivity in vitro. Fertil. Steril., 57(3):654-60, 1992.         [ Links ]

ROSNER, W. Plasma steroid-binding proteins. Endocrin. and Metab. Clin. of North America, 20(4):697-701, 1991.         [ Links ]

Sánchez, R.; Risopatrón, J.; Sepúlveda, N.; Peña, P. & Miska, W. Evaluation of the acrosomal membrane in bovine spermatozoa: effects of proteinase inhibitors. Theriogenology, 43(4):761-8, 1995.         [ Links ]

Sánchez, R.; Baltes, P.; Risopatron, J.; Villegas, J.; Peña, P.; Schill, W. B. & Miska, W. CBG like SERPIN in human fallopian tubes:Possible role in induction of the acrosome reaction. Int. J. Androl., 20 (Suppl.) 1:49, 1997.         [ Links ]

Sternberger, L. A.; Hardy, P. H.; Cuculis, J. J. & Meyer, H. G. The unlabeled antobody enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes. J. Histochem. Cytochem., 18:315-33, 1970.         [ Links ]

Stock, C.E.; Bates, R.; Lindsay, K. S.;Edmonds, D. K.;Fraser, L.R. Human ooccyte-cumulus complexes stimulate the human acrosome reaction. J. Reprod. Fertil., 86:723-30, 1989.         [ Links ]

TESARIK, J. Comparison of acrosome reaction-inducing activities of human cumulus oophorus, follicular fluid and ionophore A23187 in human sperm populations of proven fertilizing ability in vitro. J. Reprod. Fertil.,74(2):383-8, 1985.         [ Links ]

Tesarik, J. & Mendoza, C. Defective function of a nongenomic progesterone receptor as a sole sperm anomaly in infertile patients. Fertil. Steril., 58(4):793-7, 1992.         [ Links ]

Tesarik, J.; Moos, J. & Mendoza, C. Stimulation of protein tyrosine phosphorylation by a progesterone receptor on the cell surface of human sperm. Endocrinology, 133(1):328-35, 1993.         [ Links ]

Yanagimachi, R. & Usui, N. Calcium dependence of the acrosome reaction and activation of guinea pig spermatozoa. Exp. Cell. Res., 89:161-74, 1974.         [ Links ]

Yang, J.; Serres, C.; Philibert, D.; Robel, P.; Baulieu, E.E.; Jouannet, P. Progesterone and RU486: opposing effects on human sperm. Proc Natl Acad Sci U S A, 91(2):529-33, 1994.         [ Links ]

Dirección para correspondencia:
Prof. Patricio Peña S.
Depto. de Ciencias Básicas
Facultad de Medicina
Universidad de La Frontera
Casilla 54-D
Temuco - CHILE

Email:ppena@ufro.cl

Recibido : 03-04-2000
Aceptado: 12-05-2000