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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.27 n.5 Santiago oct. 2010

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182010000600002 

Rev Chil Infect 2010; 27 (5): 392-397

Artículo Original

 

Susceptibilidad antimicrobiana, serotipos capsulares y relación clonal entre cepas invasoras de Streptococcus pneumoniae aisladas de pacientes adultos de la Región del Bío-Bío, Chile. Período 2005-2006

Antimicrobial susceptibility, capsular serotypes and clonal relationship of invasive Streptococcus pneumoniae isolates in adult population of the Bio-Bio Region, Chile. 2005-2006

 

Cristian Aguilera R., Gerardo González R., Helia Bello T., Sergio Mella M., Rodrigo Blamey D.*, Henriette Chabouty G., Juan C. Hormazábal O., Aurora Maldonado B., Bianca Rojas U., Mabel Seoane M. y Mariana Domínguez Y.

Universidad de Concepción, Chile. Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología, Laboratorio de Antibióticos (CAR,GGR, HBT, MDY).Chile.

Universidad de Concepción, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina Interna (SMM).Chile.

Hospital Clínico Regional de Concepción, Unidad de Infectología (SMM, RBD*).Chile.

Hospital Clínico Regional de Concepción, Laboratorio de Microbiología (HCG).Chile.

Instituto de Salud Pública, Laboratorio Nacional de Referencia de Streptococcus pneumoniae (JCHO, AMB, BRU, MSM).Chile.

*Actualmente se desempeña en Hospital Del Salvador, Santiago, Chile.

Dirección para correspondencia


Resumen

Las infecciones ocasionadas por Streptococcus pneumoniae constituyen un problema de salud pública. En nuestro país existe escasa información sobre aislados de procesos bacteriémicos en población adulta. Se estudió la susceptibilidad, serotipos y relación clonal de 56 aislados de S. pneumoniae desde hemocultivos, entre enero 2005 y agosto 2006, de pacientes adultos de la intercomuna Concepción-Talcahuano, Región del Bío-Bío, Chile. Se encontró resistencia a tetraciclina (21,4%), cotrimoxazol (18%), eritromicina (18%), cloranfenicol (7%) y a penicilina en un solo aislado procedente de un foco meníngeo (2 %). La totalidad mostró susceptibilidad a cefotaxima, levofloxacina, moxifloxacina y vancomicina. Se demostró una amplia variedad de serotipos capsulares, con predominio de los serotipos 1, 5, 23F, 7F y 3. El análisis de macrorestricción y electroforesis en campo pulsado reveló 31 patrones electroforéticos con 12 grupos clona-les, descartando un clon predominante. De acuerdo a los resultados, al menos 80% de los serotipos de aislados de S. pneumoniae de procesos bacteriémicos están incluidos en la vacuna comercial disponible.

Palabras clave: Streptococcus pneumoniae, serotipos capsulares, electroforesis en gel en campo pulsado.


Streptococcus pneumoniae infections constitute a public health problem. In our country there is scarce information regarding isolates from bacteraemic episodes in adult population. The antibiotic susceptibility, sero-types and clonal relationship of 56 isolates of S. pneumoniae from adult patients with bacteraemic infections in Concepcion-Talcahuano, Bio-Bio Region, Chile, were studied. Resistance to tetracycline (21.4%), trimethoprim/ sulfamethoxazole (18%), erythromycin (18%), chloramphenicol (7%) and 1 penicillin resistant isolate from a meningeal focus (2%) was found. Also, all the isolates were susceptible to cefotaxime, levofloxacin, moxifloxacin and vancomycin. A wide variety of capsular serotypes was demonstrated, with predominance of serotypes 1, 5, 23F, 7F and 3. The macrorestriction analysis by pulse field electrophoresis revealed 31 electrophoretic patterns and 12 clonal groups, discarding a predominant clone. According to the results, at least, 80% of the S. pneumoniae serotypes isolated from bacteraemic adult patients are included in the available commercial vaccine.

Key words: Streptococcus pneumoniae, serotypes, pulse field gel electrophoresis.


 

Introducción

S treptococcus pneumoniae, patógeno extracelular clásico, mantiene un papel preponderante como agente etiológico de infecciones menores o no invasoras (otitis media aguda, sinusitis aguda) e infecciones invasoras (neumonía, meningitis bacteriana aguda, bacteriemia y, menos frecuentemente, artritis o peritonitis)1. Las infecciones invasoras por S. pneumoniae constituyen un serio problema de salud pública en el ámbito mundial y, particularmente, en países en desarrollo, debido a su elevada mortalidad2. El compromiso del torrente circulatorio por esta bacteria, particularmente en el contexto de una neumonía, podría agravar el pronóstico3. La habilidad de S. pneumoniae para causar enfermedad está directamente relacionada con la presencia de una cápsula polisacárida que se encuentra rodeando la pared bacteriana. Los polisacáridos capsulares son de naturaleza química variada y actúan como antígenos específicos; los distintos serotipos se comportan de manera diferente en cuanto a su capacidad antigénica, virulencia y propiedad colonizadora4.

Otro factor que explica la importancia que ha adquirido este patógeno y que ha complicado el manejo de las infecciones neumocóccicas, es el incremento de la resistencia, inicialmente a penicilina y posteriormente a cefalosporinas y otras familias de antimicrobianos5.

Estudios de epidemiología molecular han evidenciado que el aumento de la resistencia a penicilina en S. pneumo-niae sería el resultado de dos fenómenos concomitantes, la importación de clones internacionales que poseerían un carácter epidémico y atributos especiales de virulencia y múltiples eventos de transferencia horizontal de resistencia a cepas susceptibles, que ocurren de manera independiente y localizada. Se ha logrado determinar, mediante estudios de tipificación molecular en muchas regiones del mundo, un número importante de clones de S. pneumoniae resistentes a antimicrobianos que han alcanzado una importante diseminación geográfica6.

En nuestro medio destaca la ausencia de estudios prospectivos sobre infección neumocóccica bacteriémica en adultos, dado que la información disponible en nuestro país deriva fundamentalmente de estudios en Pediatría7-10. La información sobre serotipos predominantes en la población adulta es más bien reciente y escasa, limitada poblacion adulta es mas bien reciente y escasa, limitada a la Region de la Araucania y Region Metropolitana11,12 y no incluye, necesariamente, aspectos de susceptibilidad in vitro a antimicrobianos y biologia molecular.

El objetivo de este trabajo fue determinar la susceptibilidad antimicrobiana, serotipos y relacion clonal de cepas de S. pneumoniae aisladas en episodios de bacteriemia de pacientes adultos atendidos en hospitales de la intercomuna Concepcion-Talcahuano.

Material y Metodos

Se estudio 56 aislados de S. pneumoniae provenientes del torrente circulatorio, de igual numero de pacientes
sobre 15 anos de edad, internados en el Hospital Clinico Regional de Concepcion, Hospital Higueras de Talcahuano y Hospital Naval de Talcahuano durante el periodo enero 2005-agosto 2006. Se incluyo un aislado por paciente.

Como controles se utilizaron las siguientes cepas:

. S. pneumoniae ATCC 49619 en los ensayos de susceptibilidad
antimicrobiana.
. Enterococcus faecalis ATCC 29212 para evaluar el contenido adecuado de timidina en agar y caldo
Mueller-Hinton.
. Clones internacionales Spain23F-1, Spain6B-2, Spain9V-3, Colombia5-19 y Colombia23F-26 para la determinacion de la relacion clonal entre aislados.

Identificacion y mantencion de las cepas. La identificacion se realizo de acuerdo a criterios fenotipicos y
pruebas de susceptibilidad a optoquina, solubilidad en bilis13 y kit comercial de aglutinacion con particulas de latex Dryspot Pneumo Test® (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Dos replicas de cada cepa fueron mantenidas a -80o C en el sistema de criotubos CryoBank® (Copan Diagnostics Inc., Corona, EE.UU.).

Estudios de susceptibilidad antimicrobiana

Determinacion de patrones de resistencia. Se realizo por el metodo de difusion en agar, empleando oxacilina
(1µg), eritromicina (15 µg), trimetoprim/sulfametoxazol (cotrimoxazol) (1,25/23,75 µg), tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg), levofloxacina (5 µg), moxifloxacina (5 µg) y vancomicina (30 µg), de acuerdo a las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)14, utilizando como control la cepa de S. pneumoniae ATCC 49619.

Determinacion del nivel de resistencia. En las cepas que presentaron resistencia mediante el metodo de difusion en agar, se determino la concentracion inhibitoria minima (CIM) por el metodo de microdilucion en caldo, segun los criterios del CLSI15. Se utilizaron placas de microtitulacion conteniendo penicilina G (Merck, Darmstadt, Alemania), cefotaxima (Sigma®, Chemie GMBH Alemania), cloranfenicol (Calbiochem®, Darmstadt, Alemania), tetraciclina (Calbiochem®, Darmstadt, Alemania), trimetoprim (Sigma®, Chemie GMBH, Alemania), sulfametoxazol (Sigma®, Chemie GMBH Alemania) y eritromicina (Sigma®, Chemie GMBH Alemania), en caldo Mueller-Hinton cation ajustado (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementado con 3% de sangre lisada de caballo. La cepa ATCC 49619 fue utilizada como control en los ensayos.

Serotipificacion. Las cepas de S. pneumoniae fueron serotipificadas en el Instituto de Salud Publica mediante la reaccion de Neufeld-Quellung, utilizando el kit Pneumotest® (Staten Serum Institute, Copenhague,
Dinamarca) 16,17 compuesto por 12 antisueros polivalentes y 44 factores.

Tipificacion molecular. La relacion genetica de los aislados de S. pneumoniae fue investigada por macrorestriccion del ADN cromosomico mediante electroforesis en gel en campo pulsado (ECP) segun el protocolo de Soares y cols18 y las modificaciones de Vela y cols19. En breve, los aislados fueron inoculados en 10 ml de caldo Todd-Hewitt 3% suplementado con extracto de levadura (1%), glucosa (1%) y glutamina (22 mg/ml), e incubados durante 6 horas a 37° C. Las celulas fueron recuperadas por centrifugacion, resuspendidas en PIV (NaCl-Tris 1 M pH 8,0) y mezcladas con agarosa de bajo punto de fusion (Chromosomal Grade Agarose, Bio-Rad) al 1,5% para inmovilizarlas en moldes adecuados. Los plugs fueron
tratados con 5 µg/ml de ARNasa (MBI Fermentas), 1 mg/ml de proteinasa K (Invitrogen®, Carisbad, CA) y
posteriormente, digeridos con 30 U de enzima SmaI (MBI Fermentas). Los fragmentos de restriccion fueron separados en un sistema CHEF DRIIR PFGE (Bio-Rad) en un gel de agarosa al 1% (SeaKem® Gold Agarose) con pulso inicial de 1 segundo, pulso final de 30 segundos, voltaje de 6V/cm por 23 horas a 11,3°C. Los geles fueron tenidos en una solucion de bromuro de etidio (0,7 µg/ml), lavados en agua, visualizados en un transiluminador UV y capturados con el sistema fotografico Kodak Digital Science 1D.

Los patrones de restriccion obtenidos fueron clasificados de acuerdo con los criterios de Tenover y cols20.

Resultados

De las 56 cepas de S. pneumoniae aisladas desde hemocultivos en pacientes adultos en el periodo de estudio, 59% provenian de pacientes entre 15 y 64 anos de edad y el 41% restante correspondio a personas con edad igual o superior a 65 anos. Treinta y dos por ciento de los aislados provenían de pacientes de sexo femenino y 67,8% de varones. El diagnóstico clínico y, por lo tanto, la causa de hospitalización más frecuente en estos pacientes fue la neumonía (n: 51; 91,1%), distribuyéndose los casos restantes en meningitis (n: 3; 5,3%), peritonitis (n: 1; 1,8%) y absceso amigdalino (n: 1; 1,8%).

Perfiles y niveles de resistencia. Al estudiar el comportamiento frente a los agentes antibacterianos, mediante el método de difusión en agar, se encontró que 13 cepas presentaron resistencia a penicilina; 10 cepas fueron resistentes y 9 presentaron susceptibilidad intermedia a cotrimoxazol; 12 cepas fueron resistentes a tetraciclina, 4 cepas a cloranfenicol y 10 cepas a eritromicina.

En las cepas no susceptibles por difusión en agar, se determinó el nivel de resistencia al antibacteriano correspondiente. Para el caso de los β-lactámicos, de las 13 cepas con un halo de inhibición de oxacilina < 19 mm, 11 de ellas presentaron susceptibilidad intermedia a penicilina (CIM 0,125 -1 µg/ml) y 2 fueron susceptibles a este antibacteriano (CIM < 0,06 µg/ml) de acuerdo a la antigua recomendación del CLSI.15 Sin embargo, según los nuevos criterios del CLSI21, todos los aislados extra-meníngeos fueron susceptibles a penicilina (nuevo criterio de susceptibilidad CLSI foco extrameníngeo, CIM ≤ 2 µg/ml). De los 3 aislados meníngeos, 1 fue resistente (CIM = 0,12 µg/ml, nuevo criterio de resistencia CLSI foco meníngeo ≥ 0,12 µg/ml)21. Además, la totalidad de las cepas fue susceptible a cefotaxima (Tabla 1). Con respecto a los otros agentes antibacterianos, 18% de las cepas ensayadas presentó resistencia frente a cotrimoxa-zol; 21,4% a tetraciclina; 7,1% a cloranfenicol y 18% presentó resistencia a eritromicina. No se detectaron cepas resistentes a levofloxacina, moxifloxacina ni vancomicina.


Serotipificación. La serotipificación capsular demostró una variedad importante de tipos capsulares, con los serotipos 1, 5, 23F, 7F y 3 como prevalentes en las cepas estudiadas. Así, 52% (29/56) de los aislados analizados presentaron como antígeno capsular uno de estos cinco serotipos. El 48% restante expresó serotipos capsulares que se presentaron en una frecuencia menor a 5,4% (serotipos 6A, 14, 12F, 8, 6B, 10A, 33F, 23A, 15A, 9L, 4 y pool C) y sólo 7 cepas fueron definidas como no tipificables (Figura 1).


Tipifi cación molecular. Con los ensayos de tipificación molecular por ECP fue posible analizar 52 de los 56 aislados de S. pneumoniae, encontrándose 31 patrones electroforéticos diferentes y 12 grupos clonales (G-J, N, P, Q, S, T W, AD y AE), cada grupo constituido por 2-7 aislados con patrones de restricción genéticamente relacionados o idénticos (Figura 2 y Tabla 2). Se descartó la presencia de un componente clonal predominante. Se evidenció relación entre serotipo capsular y clonalidad al encontrar aislados genéticamente relacionados, cercanamente relacionados y, en algunas ocasiones, posiblemente relacionados, en cepas de un determinado serotipo (cepas serotipos 23F, 7F, 14, 3, 1, 5 y 12F).



Figura 2. Patrones de restriccion de ADN cromosomal por electroforesis en campo
pulsante de aislados de Streptococcus pneumoniae de procesos bacteriemicos en
pacientes adultos. λ: lambda ladder.


Discusión

En general en nuestro país, los estudios de vigilancia, con los antiguos puntos de corte del CLSI, reportaron valores de resistencia a penicilina que variaban entre 20 y 30%, con significativas variaciones regionales22,23,. Por otra parte, se ha demostrado una evidente diferencia de susceptibilidad entre los aislados de la población pediátrica en comparación con la adulta (15,1 a 7,3%) 24.

Existe poca información nacional sobre susceptibilidad in vitro, serotipificación y relación clonal de aislados de S. pneumoniae obtenidos del torrente circulatorio de población adulta.

En este estudio fue posible determinar que los aislados estudiados mantienen aún una importante susceptibilidad a penicilina, incluso utilizando los antiguos puntos de corte del CLSI (80,4% de susceptibilidad y 19,6% de cepas con susceptibilidad intermedia) y cefotaxima (100% de cepas susceptibles); según la última recomendación del CLSI, sólo un aislado de foco meníngeo fue resistente a penicilina25. Con respecto a otros antimicrobianos estudiados, se encontró resistencia particularmente a macrólidos, tetraciclina y cotrimoxazol.

La variedad de polisacáridos capsulares fue importante; sin embargo, se destaca un claro predominio de los serotipos 1, 5, 23F, 7F y 3, con frecuencia sobre 50%, comparado con los restantes serotipos (< 5,4%). La fórmula de la vacuna polisacárida que incluye los 23 polisacáridos capsulares que con mayor frecuencia se asocian con enfermedades invasoras en América del Norte (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F), presentaría una cobertura teórica de 82% de las cepas de S. pneumoniae aisladas en nuestro estudio. Este porcentaje podría ser mayor al tener presente el concepto de protección cruzada, que deriva de la similitud antigénica de los polisacáridos capsulares de aislados pertenecientes al mismo serogrupo. La inmunización con el serotipo 6B puede conferir protección frente al serotipo 6A presente en tres cepas clínicas en nuestro estudio, pero ausente de la formulación de la vacuna. Situación similar podría producirse con el serotipo 23F y los serotipos 9V, 9N, 15B, entregando un efecto protector frente al serotipo 23A y serotipos 9L y 15A, respectivamente. Con esto, teóricamente, la cobertura en términos del nivel de protección inmunológica entregada, podría alcanzar valores cercanos a 90%.

Respecto de lo anterior, y de manera reciente, se ha propuesto un método para la determinación de serotipos y serogrupos capsulares en cepas de S. pneumoniae, que combina la amplificación del locus capsular completo y la posterior digestión de ese amplicón logrando patrones de restricción serotipo-específico (RCP-RFLP) y generando una base de datos que permitiría, de manera simplificada, lograr un mayor poder discriminatorio en la identificación26.

El estudio de relación genética mediante ensayos ECP revela una gran diversidad clonal en las cepas de S. pneumoniae investigadas, sin un componente clonal prevalente, como tampoco relación con clones internacionales circulantes en países sudamericanos y descritos en pacientes pediátricos (Spain23F-1, Spain6B-2, Spain9V-3, Colombia5-19 y Colombia23F-26)6,10,19, 27-30.

Además, se evidenció la relación entre serotipo capsular y clonalidad, al determinar la presencia, en cepas con un determinado polisacárido capsular, de aislados genéticamente relacionados, cercanamente relacionadas y, en algunas ocasiones, posiblemente relacionados (cepas serotipo 23F, 7F, 14, 3, 1, 5 y 12F).

En resumen, nuestro estudio confirma la susceptibilidad a penicilina de cepas aisladas del torrente circulatorio de población adulta de la intercomuna Concepción-Talcahuano, de acuerdo a cualquiera de los puntos de corte propuestos por el CLSI. De hecho, si se utilizan los puntos de cortes propuestos por el Drug Resistant Streptococcus pneumoniae Therapeutic Group31 y los nuevos puntos de corte del CLSI, habría sólo un aislado –procedente de foco meníngeo– resistente a penicilina. Por otra parte, se demuestra la ausencia de un clon predominante y de un serotipo en particular, incluidos aquellos de amplia distribución geográfica.

Finalmente, debe destacarse que el número de aislados representa sobre 90% de los aislados del torrente circulatorio recolectados anualmente en los hospitales Clínico Regional de Concepción y Naval de Talcahuano, lo que asociado al diseño descriptivo y el período estudiado (enero 2005-agosto 2006) hace metodológicamente imposible establecer comparaciones sobre endemicidad y enfermedad serotipo-específica como la estudiada en pediatría32. A pesar de lo anterior, destaca la amplia variabilidad de serotipos identificados y patrones electroforéticos encontrados, con ausencia de clones epidémicos y la evidente susceptibilidad a penicilina con cualquiera de los puntos de corte establecidos, información que nuestro grupo ha sido enfático en propiciar y utilizar33,34.

Agradecimientos: A los profesionales de los Laboratorios de Microbiología, Angelo Cabezas (Hospital Naval), Pamela Rojas y Alejandra Soto (Hospital Higueras) y Nancy Henrí-quez (Hospital Guillermo Grant Benavente) por proporcionar las cepas empleadas en este estudio.

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Correspondencia a: Mariana Domínguez Yévenes mdomingu@udec.cl

Trabajo financiado por Proyecto DIUC 205.085.029-1.0

Recibido: 27 de julio de 2009 Aceptado: 29 de julio de 2010.