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Archivos de medicina veterinaria

versión impresa ISSN 0301-732X

Arch. med. vet. v.29 n.2 Valdivia  1997

http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X1997000200004 

Confiabilidad en la determinación de prevalencia
de infección por Mycobacterium bovis en ganado bovino por
decomisos en frigoríficos

O. LATINI1, Bioq.; A.M. CANAL2, M.V.; M.E. FERRARA4, Bioq.; M.D. SEQUEIRA1, Bioq.;
G. SEQUEIRA3, M.V.; R. BAGNAROLI3, Dr. Med. Vet.; P. TORRES5, M.V.

1Instituto Nacional de Epidemiología "E. Coni", Santa Fe. 2Dirección de Sanidad Animal, Min. Agricultura, Ganadería, Industria y Comercio, Avenida Pellegrini 3100, 3000 Santa Fe. 3Programa Provincial de Control de Zoonosis, Min. Salud y Medio Ambiente, Provincia de Santa Fe. 4Com. Micobacterias, Asoc. Arg. Veterinarios de Laboratorio Diagnóstico. 5Programa Nac. de Control y Erradicación de Tuberculosis GELSA SENASA, Argentina.

SUMMARY

Reliability of the prevalence of Mycobacterium bovis in cattle by rejection in abattoirs

Bovine tuberculosis is still a serious problem both for human and animal health. Control or erradication programs should start with knowledge about the prevalence for zones to establish priorities.

The rejection of carcasses and viscera of slaughtered animals constitutes a good indicative, as long as it is reliable. Organs from 248 animals with suspicious tuberculosis lesions were obtained in 6 abattoirs and examined with bacteriological and histopathological corroboration tests in Santa Fe, Argentina. Reliability was near 89%, which certifies the responsibility of the inspectors in efforts to erradicate tuberculosis.

Palabras claves: tuberculosis, Mycobacterium bovis, decomisos, bovinos.

Key words: tuberculosis, Mycobacterium bovis, rejection, cattle.

INTRODUCCION

La tuberculosis bovina constituye aún en nuestro país un serio problema de salud humana y animal, con grandes repercusiones económicas (SENASA, S.E.A.G. y P., 1994).

Si bien desde la década del 40 prácticamente ha desaparecido la tuberculosis causada por Mycobacterium bovis (M. bovis) en humanos relacionada con la ingesta láctea, debido al hervido, pasteurización de la leche y al desarrollo de la industria láctea, aún se encuentra una proporción relativamente alta de tuberculosis de este origen entre el total de enfermos.

Las principales fuentes de infección actuales del hombre son: aerosoles en galpones o al aire libre a partir de la tos del ganado enfermo, aerosoles en los frigoríficos o cortes en las manos durante la faena (Brown y col., 1994).

La provincia de Santa Fe, en la que se realiza tipificación sistemática de los aislamientos de micobacterias, es la que presenta la prevalencia más elevada de tuberculosis causada por M. bovis en el hombre, con un promedio de 2.4% del total de las tuberculosis en los últimos 15 años (Sequeira y Latini, 1990).

En la mayoría de los pacientes se puede establecer una fuerte asociación con la condición de zoonosis laboral: empleados de frigoríficos, veterinarios, peones rurales y transportistas de ganado. En estos casos debe contarse no sólo el sufrimiento humano sino también las pérdidas económicas producidas por costos de atención médica y lucro cesante, ya que se diagnostica principalmente en el grupo de plena edad productiva.

Las cifras de pérdidas por deterioro de ganado bovino y porcino han sido estimadas, desde hace décadas, en millones de dólares anuales, debido a la disminución de producción cárnea y láctea, costos de insumos sanitarios y decomisos en frigoríficos. En estudios recientes se estimaban las pérdidas en aproximadamente 63 millones de dólares anuales (Nader y Husberg, 1988). En 1971, el Servicio de Lucha Sanitaria (SELSA), junto al Centro Panamericano de Zoonosis (CEPANZO), estimaban que un 3-4% de la población bovina total del país estaba infectada; sólo en la provincia de Buenos Aires un 60% de los rebaños lecheros poseían animales enfermos (SELSA-CEPANZO, 1971). La situación actual puede ser al menos similar, aunque no se cuenta con estudios confiables sobre el tema.

Si bien durante años se ha incentivado el control de tuberculosis en el ganado lechero, por medio de pagos preferenciales por leche de animales sanos, en la provincia de Santa Fe no se efectúan estudios sistemáticos que permitan establecer la proporción de ganado bovino y porcino o rebaños infectados. Este dato se considera indispensable para encarar programas de control y erradicación. Actualmente se está tratando de implementar un programa voluntario de erradicación, en el cual se plantea, entre otras estrategias, el fortalecimiento de la Vigilancia Epidemiológica, incorporando entre sus actividades rutinarias la investigación a partir de la inspección sanitaria en mataderos (OPS-OMS, 1993).

La prevalencia de infección puede estimarse por varios métodos. En los primeros estadíos de un programa de control, en zonas donde se estima una alta prevalencia, la magnitud puede estimarse por la proporción de lesiones tuberculosas macroscópicas durante el examen post mortem en los sitios de faena. Este dato se extrapola a la población ganadera de la zona, considerando que, además, una proporción del ganado estará infectado sin haber desarrollado aún lesiones.

Esta estimación adolece de algunos sesgos ya que depende de la edad y tipo de los animales faenados que pueden no ser representativos de la población ganadera de la región, de la proporción de animales infectados en la zona (reactores positivos) y de la confiabilidad de los profesionales y técnicos en reconocer lesiones tuberculosas.

A medida que desciende la prevalencia de animales enfermos se hacen necesarios estudios más objetivos, sensibles y específicos como la prueba tuberculínica y el cultivo y tipificación de micobacterias a partir de material linfático (Roberts, 1986; Corner, 1994).

En la provincia de Santa Fe la prevalencia de tuberculosis bovina y porcina es alta, razón por la cual en 1991 se decidió efectuar una estimación utilizando el primer método descrito. Dicho estudio fue realizado por el Ministerio de Agricultura y Ganadería, el Programa Provincial de Zoonosis, el Instituto Nacional de Epidemiología “E. Coni” y el SENASA y contemplaba el estimar la prevalencia de tuberculosis, cisticercosis, hidatidosis y distomatosis (Sequeira y col., 1993). En el cuadro 1 se resumen los hallazgos referidos a tuberculosis en la provincia de Santa Fe.

Cuadro 1

Ganado bovino faenado y decomisos por tuberculosis
por frigorífico. Provincia de Santa Fe. Período
1990-1991.

Slaughtered bovines and rejections due to TBC per abattoir
 

Total 
Decomisos 
Frigorífico
  faena 
tuberculosis 
 
  N° 
     N° 
 % 

Nelson 
  40.064
      853 
  2.12 
San Jorge 
  70.312 
  3.608 
  5.13 
Uncoga 
  32.308 
      894 
  2.76 
Friar 
  50.232 
  5.771 
11.48 
Coop. Car. 
16.245 
1.341 
8.25 
Hughes 
  11.500 
        69 
  0.59 
Recreo 
     4.170 
      332 
  7.96 
La Tropa 
  56.720 
  2.609 
   4.59 
Vera 
    7.303 
      747 
 10.22 

Total 
288.914 
16.224 
   5.61 

Tal como se consideró anteriormente, el estudio podría haber tenido un sesgo técnico si los profesionales y técnicos que realizaban los exámenes y decomisos no hubieran sido confiables en su diagnóstico al observar lesiones macros-cópicas en la carcasa de los animales faenados. Las experiencias al respecto han sido disímiles ya que, por una parte, en estudios realizados en otras provincias se encontró una concordancia entre diagnóstico macroscópico y aislamiento de M. bovis cercana al 54%, lo que invalidaría cualquier estimación, mientras que en un estudio piloto realizado por los autores en un frigorífico de Santa Fe, la concordancia entre lesiones y laboratorio fue superior al 90% (datos no publicados).

Por esta razón las instituciones coordinadoras consideraron conveniente realizar un estudio que permitiera establecer la confiabilidad de las estimaciones realizadas. Este estudio fue auspiciado por la Comisión de Micobacterias de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios Diagnósticos.

OBJETIVOS1. Determinar la concordancia del decomiso veterinario macroscópico por tuberculosis en la faena con el aislamiento y tipificación de micobacterias de los materiales decomisados y los estudios anatomopatológicos de las mismas piezas.

2. Identificar factores técnicos y operacionales que puedan mejorar el diagnóstico bacteriológico e histopatológico.

MATERIAL Y METODOS

MATERIAL. Participantes. Participaron del estudio seis frigoríficos Tipo A de la provincia de Santa Fe: CEPA de Venado Tuerto, Friar de Reconquista, Rafaela de Rafaela, Recreo de Recreo, Swift Armour de Rosario y Uncoga de Rafaela.

A cada uno de ellos se les solicitó conservar y enviar muestras de lesiones sospechosas de tuberculosis de 50 animales a partir de un momento determinado y hasta completar el número de muestras establecido. La toma de muestras se realizó durante el primer semestre de 1994.

Toma de muestras. Si bien en general se acepta que se deben tomar al menos tres muestras por animal, en lo posible nódulos linfáticos mesentéricos, bronquiales y retrofaríngeos (Corner, 1994), no se estableció un patrón de toma de muestras. La sistematización del examen post mortem se dejó a criterio de los profesionales y técnicos de cada frigorífico para evaluar la confiabilidad de los mismos en las condiciones habituales de trabajo. En general se recogieron una o dos muestras por animal sospechoso, de las que se realizaron los estudios histopatológicos y bacteriológicos.

Se consiguieron muestras de 248 animales; en 207 de ellos se tomó una sola muestra, mientras que en los restantes se obtuvieron muestras de dos lesiones.

Por inconvenientes surgidos en el frigorífico CEPA sólo se pudieron procesar muestras de 6 animales de esta procedencia. En otro frigorífico se tomaron muestras de 37 animales; en los 4 establecimientos restantes se recogieron 50 o más muestras (cuadro 3).

METODO. Recolección y conservación de las muestras. Cada una de las piezas decomisadas fue dividida en dos fracciones: una de ellas se colocó en un envase estéril con la finalidad de realizar el examen bacteriológico y la otra porción en un frasco con formol tamponado al 10% para su posterior estudio histopatológico. En los casos en que se obtuvo más de una muestra de un mismo animal, las mismas se colocaron en el mismo envase, razón por la cual la unidad de análisis de resultados se referirá a animales y no a piezas anatómicas.

Los frascos fueron rotulados con nombre del frigorífico, tipo de material, fecha de faena y número de tropa.

Durante el lapso comprendido entre la toma de muestra y el envío al laboratorio del Instituto Nacional de Epidemiología “E. Coni”, que nunca fue susperior a 7 días, las muestras para bacteriología fueron conservadas a 4-6° C. En el laboratorio el material fue clasificado y conservado en congelación (-20° C) hasta el momento de procesarlo.

Examen bacteriológico. Se seleccionaron trozos de tejido de la lesión y material caseoso aledaño, los que fueron disgregados en mortero; en los casos en que se disponía de muestras de dos lesiones del mismo animal se procesaron conjuntamente. Del material disgregado se realizaron extendidos en portaobjetos, los que luego fueron coloreados por la técnica de Ziehl-Neelsen.

El resto del material se procesó para cultivo, utilizando dos técnicas de decontaminación y homogeneización: por el método de Petroff, utilizando hidróxido de sodio al 4% y con ácido sulfúrico al 4% V/V (OPS-CEPANZO, 1987). Los sedimentos obtenidos con ambas técnicas de decontaminación se sembraron en una serie de dos tubos de medio de Stonebrink y uno de medio de Lowenstein Jensen preparados en el Laboratorio del Instituto. Se optó por no sembrar los materiales sin decontaminación previa debido a que la toma de muestra no se realizó en condiciones de esterilidad.

Comprobado el desarrollo de colonias ácido-alcohol resistentes se realizaron subcultivos de las mismas en medios de Stonebrink y de Lowenstein Jensen y se determinaron las siguientes características de cultivo y pruebas bioquímicas de identificación: morfología, pigmentación, tiempo de desarrollo, medio de cultivo en el que se desarrollaron, desarrollo a temperatura ambiente, pruebas de niacina, reducción de nitrato, catalasa a 68° C, pirazinamidasa y desarrollo en hidracida del ácido tiofencarboxílico (TCH) (Kantor, 1979).

Se estableció considerar como agentes causales de enfermedad a los aislamientos de colonias de M. bovis, M. tuberculosis o de micobacterias del complejo M.A.C. aún cuando fueran de bajo número de colonias; las otras micobacterias que pudieran aislarse sólo se considerarían causales si estuvieran en muy alto número.

Examen histopatológico. Las muestras se recibieron fijadas en formol tamponado al 10%; una vez en el laboratorio de la Dirección de Sanidad Animal fueron laminadas, deshidratadas en alcoholes (70°, 80°, 90°), clarificadas en xilol e incluidas en parafina. Posteriormente se realizaron cortes de 5-8 µ en micrótomo Minot y se tiñeron con la técnica de hematoxilina eosina. Se consideraron lesiones de tuberculosis a aquellas en las que se observó inflamación granulomatosa con pequeños o grandes centros de necrosis caseosa, presencia de numerosas células epitelioides, células gigantes de Langhans, linfocitos, células plasmáticas y tejido de granulación en la periferia (granuloma tuberculoso) (Jubb y col., 1985). En los casos en los que se obtuvieron muestras de dos lesiones del mismo animal los resultados se refirieron a un solo animal.

RESULTADOS

Bacteriología. Se obtuvieron resultados positivos a la baciloscopía en 113 muestras (45.6%); en el cuadro 2 se puede observar la frecuencia de aislamientos de micobacterias en los cultivos.

Cuadro 2

Aislamiento de Mycobacterium bovis en decomisos
por tuberculosis en ganado bovino. Santa Fe, 1994.

Isolation of M. bovis in bovine rejections due to TBC

Aislamiento
Frecuencia 
 
%

Mycobacterium Bovis
209
83.3
Negativo
  35 
14.1 
Microbacterias saprófitas
   4 
  1.6 

Total
248 
100.0 

Las micobacterias no patógenas fueron M. gastri, M. flavescens, M. phlei y M. triviale. No se aisló en ningún caso M. tuberculosis o M.A.C. El porcentaje de aislamiento de M. bovis en estas muestras fue similar con ambos métodos de decontaminación; en los cultivos decontaminados con ácido sulfúrico desarrolló en promedio un mayor número de colonias aunque el porcentaje de contaminación fue mayor. El alto porcentaje (84.3%) se obtuvo tomando como positivas las muestras que tuvieron desarrollo en cualquiera de los cultivos. En el cuadro 3 se relacionan los resultados de las dos técnicas bacteriológicas.

Cuadro 3

Resultados de baciloscopía y cultivo en decomisos
estudiados. Santa Fe, 1994.

Results of baciloscopy and culture in the
rejections studied.
 

Resultado de la
Resultado del cultivo 
baciloscopía
Positivo 
Negativo 
Total 

Positivo
110 
  3 
113 
Negativo
103 
32 
135 

Total
213 
35 
248 

En tres muestras la baciloscopía fue positiva y en los cultivos no se aislaron micobacterias; estas muestras provenían del mismo frigorífico, hecho que se explicaría por la posible pérdida de viabilidad de los bacilos durante la toma de muestra, conservación o la decontaminación, debido a que estos métodos decontaminantes pueden llegar a destruir casi un 90% de las micobacterias.Estas consideraciones pueden aplicarse también a otras muestras que dieron resultado negativo a la baciloscopía.

Se consideraron confirmados bacteriológica-mente sólo a los animales en cuyos cultivos se aisló M. bovis, independientemente del resultado de la baciloscopía.

El rango de confirmación varió entre un 68.5% y un 96.0% (cuadro 4), exceptuando al frigorífico de menor confirmación, el promedio de los restantes alcanzó el 88%.

Cuadro 4

Frecuencia de aislamiento de Mycobacterium bovis
en decomisos bovinos por frigorífico. Santa Fe, 1994.

Isolation frequency of M. bovis in bovine rejections
per abattoir.

Frigorífico
Animales 
estudiados 
Frecuencia 
M.bovis
Nº 

Cepa 
   6 
 83.3 
Friar 
 50 
48 
96.0 
Rafaela 
 37 
33 
89.2 
Recreo 
 51 
41 
80.4 
Swift Armour
 50 
45 
90.0 
Uncoga 
 54 
37 
68.5 

Total 
248 
209 
84.3 

Con respecto a la positividad bacteriológica según tipo de material, se analizaron los resultados de muestras de 207 animales que estaban constituidas por una sola pieza decomisada (cuadro 5).

Cuadro 5

Tejidos examinados y rendimiento bacteriológico en muestras de lesiones sospe-
chosas de tuberculosis en ganado bovino. Santa Fe, 1994.

Tissues examined and bacterial counts in samples of doubtful TBC lesions in bovines.
 

Localización
Frecuencia
Aislamiento de M. bovis
 
%
%

Pulmón
   82
   39.6
   65
   79.3
Ganglios linfáticos
   44
   21.2
   41
   93.2
Pleura
   41
   19.8
   38
   92.7
Cabeza
   14
      6.8
     9
   64.3
Mesenterio
   11
     5.3
     7
   63.6
Hígado
   10
     4.8
     9
   90.0
Peritoneo
      4
     1.9
     4
100.0
Rumen
      1
     0.5
     1
100.0

Total
207
100.0
174
   84.1

Los decomisos más frecuentes fueron los pulmonares y pleurales (123/207), un 59.4% del total; de éstos se aisló M. bovis en el 83.7% de las muestras.De los 44 ganglios linfáticos recibidos, la confirmación bacteriológica de M. bovis fue del 93.2%, la localización de mayor rendimiento (cuadro 6).

Cuadro 6

Aislamiento de M. bovis de lesiones ganglionares
sospechosas de tuberculosis en ganado bovino.

Santa Fe, 1994.

Isolation of M. bovis from doubtful TBC lesions in bovines.

Ganglio linfático
Frecuencia
Confirmación
bacteriológica 
     
 
%
%

G. prepectoral
  8
 18.0
  6
  75.0
G. retrofaríngeo
6
13.6
6
100.0
G. retromamario
4
9.1
4
100.0
G. ilíaco
3
6.9
3
100.0
G. precrural
3
6.9
3
100.0
G. preescapular
3
6.9
3
100.0
G. inginal
2
4.5
2
100.0
G. subdorsal
2
4.5
2
100.0
G. parotídeo
1
2.3
0
-
G. supraesternal
1
2.3
1
100.0
Ganglios sin especificar
11
25.0
11
100.0

Total
44
100.0
41
93.2

Se obtuvieron 26 muestras de tejidos de la región abdominal, con una confirmación del 80.7%.

El menor porcentaje de confirmación se encontró en las muestras obtenidas de cabeza y de mesenterio.

Histopatología. Se obtuvieron resultados por histopatología de 229 muestras del total recibido, debido a que 19 no se encontraban correctamente fijadas. Del estudio histopatológico, 203 muestras presentaron granuloma tuberculoso, observándose en las restantes linfoadenitis crónica (8), actinobacilosis (7), tejido de granulación (5), abscesos (4), granuloma parasitario (1) y carcinoma de pulmón (1). Al relacionar los resultados histopatológicos con los aislamientos de M. bovis, se pudo comprobar una concordancia en 203 (88.6%) muestras, de las cuales 187 correspondieron a muestras positivas y 16 a muestras negativas (cuadro 7).

Cuadro7

Relación entre bacteriología e histopatología en el
diagnóstico de tuberculosis bovina a partir de
materiales de decomiso. Santa Fe, 1994.

Relationship between bacteriological and histopathological
diagnosis of TBC from rejected material in abattoirs.

Cultivo
Histopatología
Total
 
Positivo
Negativo
 

Positivo*
187
10
197
Negativo
 16
16
 32

Total
203
26
229

*Aislamiento de M. bovis.

De las 16 muestras con cultivo negativo e histopatología positiva, 10 correspondieron al frigorífico de menor rendimiento en la bacteriología; las seis muestras restantes se distribuyen en forma homogénea entre el resto de los frigoríficos. De las 10 muestras positivas a la bacteriología y que no presentaban granuloma tuberculoso en la histopatología, la mayoría correspondió a diagnóstico histológico de linfoadenitis crónica y tejido de granulación.

DISCUSION

El aislamiento de micobacterias del Complejo Tuberculosis, principalmente M. bovis, de tejidos o secreciones es el método de referencia para certificar que el animal del cual provienen está enfermo. La especificidad del cultivo es del 100% y la sensibilidad, aunque cercana a este valor, puede ser algo más baja dependiendo del grado de evolución de la lesión. La baciloscopía, en cambio, tiene una sensibilidad baja, cercana al 50%.

Sin embargo, en la práctica, la sensibilidad de los cultivos de piezas decomisadas en frigoríficos está disminuida debido a las condiciones en que se realiza la toma de muestras; las mismas no se toman con la esterilidad requerida, el envío a los laboratorios no puede hacerse inmediatamente de realizada la toma, sino que generalmente se envían cuando se ha recogido un cierto número de muestras y la conservación generalmente es a 4° C y no a -20° C. Todo esto contribuye a que una proporción de bacilos pierda viabilidad, lo que explicaría el hallazgo de tres muestras con baciloscopía positiva y cultivo negativo, y a que sea imprescindible decontaminar las muestras antes de sembrarlas, reduciendo por estos procedimientos el número de bacilos, al menos, a la décima parte de su valor inicial, razón por la cual se utilizaron 2 técnicas de decontaminación tratando de minimizar estas pérdidas de viabilidad.

El examen histológico, por el contrario, tiene alta sensibilidad pero la especificidad puede estar disminuida por la presencia de otros agentes causales de lesiones granulomatosas. En la práctica la sensibilidad podría disminuir porque no se realizó el corte en las áreas más afectadas al tomar la muestra, predominando tejido de zonas periféricas.

Las discordancias observadas entre técnicas bacteriológicas, baciloscopía positiva con cultivo negativo, y entre cultivo negativo e histopatología positiva, se asocian a las muestras provenientes de uno de los frigoríficos, por lo que podría suponerse que la discordancia entre técnicas no es real, sino que hubo algún error en la toma, conservación o envío de las muestras provenientes de ese frigorífico; aceptando esta hipótesis dicho frigorífico hubiera alcanzado un 87% de confirmación bacteriológica de sus materiales, proporción muy cercana al resto de los frigoríficos.

Por lo tanto, la confirmación por cultivo del 84.3% de las muestras (cuadro 5) y por anatomía patológica del 88.6% (cuadro 7) indican que los profesionales y técnicos de los frigoríficos participantes tienen una gran habilidad para diagnosticar las lesiones tuberculosas macroscópicas en animales faenados, hecho importante para evaluar programas de control, especialmente en las fases de menor prevalencia.

Se puede afirmar que las zonas con mayor prevalencia de tuberculosis bovina en la provincia de Santa Fe (cuadro 1) son los departamentos de General Obligado y Vera, cuyos animales son faenados en los Frigoríficos Friar y Vera; esta observación podría contribuir a ayudar a las autoridades a fijar prioridades en las acciones de control.

Este trabajo ha demostrado, además, que aproximadamente el 59.1% de las tuberculosis bovinas tienen localización pulmonar, las cuales pueden ser transmitidas a los trabajadores rurales; la prevalencia definirá las zonas de mayor riesgo laboral en campo y frigoríficos que faenen animales de dichas zonas.

El cultivo de lesiones es una excelente técnica patrón que podrá ser utilizada como referencia en estudios posteriores.

La anatomía patológica demostró también ser una técnica sensible para confirmar las lesiones sospechosas; la mayor discordancia con el diagnóstico bacteriológico se encuentra en los diagnósticos de linfoadenitis crónica y tejido de granulación.

Probablemente sea necesario difundir con mayor énfasis las normas referentes a la toma, conservación, envío y procesamiento de las muestras para optimizar los resultados bacteriológicos e histopatológicos.

El estudio debería repetirse periódicamente como control de calidad.

RESUMEN

La tuberculosis bovina es aún un serio problema de la salud humana y animal. Los programas de control o erradicación deben partir de un conocimiento de la prevalencia por zonas para fijar prioridades. El decomiso en animales de faena constituye un buen indicador, siempre que sea confiable. En la provincia de Santa Fe, Argentina, se realizaron estudios de confirmación bacteriológica y anatomía patológica sobre muestras de lesiones sospechosas de tuberculosis en 248 bovinos procedentes de 6 frigoríficos. La confiabilidad fue cercana al 89%, lo que certifica la importancia del inspector de frigorífico como operador en los planes de control y erradicación de tuberculosis.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración de los profesionales veterinarios de los frigoríficos participantes Dres. Sara I. Bertero, Alberto F. Borello, Víctor D. Di Pascuale, Eduardo R. Escalada y Carlos Roldán, como así también el apoyo en Laboratorio de las Dras. Norma Russi (F.A.V.E.) y Liliana H. de Virgilio (MAGIC).

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